Методика постановки реакции связывания комплемента при сапе

Реакция производится в водяной бане при общем объёме 2,5 см3

Всех компонентов при 37—38°С.

Компоненты реакции

а) гемолизин—рабочий титр не менее 1 :1 000;

б) сапной антиген—экстракт сапного микроба;

в) свежая или консервированная сыворотка морской свинки (комплемент);

г) испытуемая сыворотка и сыворотки (нормальная и санная) для титрации комплемента в бактериологической системе, инактивпрованные в день постановки реакции при температуре 58.—59°С в течение 30 минут.

д) 2,5 °/о взвесь эритроцитов от осадка в физиологическом растворе (1 :40);

е) физиологический раствор 0,85 °/о химически чистой поваренной соли на дестиллированной воде.

Гемолизин и сапной антиген изготовляют централизованно на биофабриках.

Титрация компонентов реакции

Перед реакцией производят титрацию гемолизина и комплемента в гемолитической системе и комплемента в бактериологической системе.

Титра ция гемолизина

При титраций гемолизина делают следующие разведения: 1 :100; (основное разведение); 1; 500; 1:1 000; 1:1 500; 1:2 000; 1:2 500; 1:3000; 1:3500; 1:4000 и т. д.

Если гемолизин консервирован карболовой кислотой, то берут 0,1 гемолизина на 9,9 физиологического раствора (1:100), если же он консервирован глицерином, то следует брать 0,2 см3 гемолизина на 9,8 физиологического раствора (обычно на фабрике и принято консервировать гемолизин глицерином).

Комплемент употребляют в разведении 1 :20 по 0,5 см3 и эритроциты—2,5 °/о взвесь из осадка по 0,5 см3. Взамен сапного антигена и сыворотки лошади в пробирки прибавляют 1 см3 физиологического раствора. Продолжительность реакции—10 минут в водяной бане при 37—38°С. Титр гемолизина—наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,5 см3 взвеси эритроцитов при комплементе 0,5 см3 разведения 1 :20- при 37—38° С в течение 10 минут.

Рабочей дозой гемолизина’ для дальнейших титраций комплемента и сапного антигена, а также для реакции при испытании подозрительных по сапу сывороток (главного опыта) считается удвоенный титр гемолизина.

При титрации гемолизина ставят следующие контроли: 1) контроль гемолизина (т. е. Гемолизкн 1 :100 + эритроциты + физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии комплемента); 2) комплемента (т. е. комплемент + эритроциты +физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии гемолизина и 3) физиологического раствора (т. е. эритроциты + физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии гемолизина и комплемента). Во всех контрольных пробирках гемолиз эритроцитов отсутствует. Для дальнейшей работы допускается смешивание гемолизина и эритроцитов в одинаковых объёмах.

Титрация комплемента в гемолитической системе

Комплемент исследуют в таких дозах; 0,1; 0,13; 0,16; 0,19; 0,22 и т. д. с интервалами по 0,03 до 0,49 комплемента в разведении 1 :20. В каждую пробирку до недостающего количества (объёма) в 0,5 см3 доливают физиологический раствор (в первую пробирку 0,4 см3 физиологического раствора, во вторую—0,37 см3 и т. д.).

Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее количество, потребное для полного гемолиза 0,5 см3 взвеси эритроцитов при вытитрованной дозе гемолизина в течение 10 минут в водяной бане при 37—38°С.

Титрация комплемента в бактериологической системе

Компоненты: сапные сыворотки ++++ и ++, консервированные 5% карболово-физиологическим раствором (на 9,0 сыворотки 1,0 раствора), нормальные сыворотки—2. Сыворотки берут той же давности, что и испытуемые.

Сапные и нормальные сыворотки наливают в пробирки по 0,05 и добавляют 0,45 физиологического раствора (или делают разведение 1 :10 и разливают по пробиркам по 0,5). Разведение комплемента из основного разведения (1 :20) начинается на 2 интервала ниже против титра его в гемолитической системе: если титр комплемента в гемолитической системе 0,25, то разведение начинается с 0,19; 0,22; 0,25; 0,28 и т. д. Каждое разведение комплемента ставится с контролем без антигена. Во все пробирки до недостающей 0,5 см3 дозы комплемента добавляют физиологический раствор.

После разливки нормальных и сапных сывороток, сапного антигена в титре и соответствующих доз комплемента пробирки ставят на 20 минут и водяную баню при 37°С, после чего в них наливают по 0,5 см3 гемолизина в рабочем титре и 0,5 см3 эритроцитов барана (2,5 о/о взвесь). Время реакции в гемолитической системе—20 минут.

Титр комплемента—минимальное количество его, потребное для полного гемолиза взвеси эритроцитов в пробирках с нормальными сыворотками с антигеном и без антигена, и с сапной сывороткой без антигена, при соответствующей задержке гемолиза в сапной сыворотке с антигеном при 37°С в течение 20 минут.

Разведение комплемента для главного опыта

Допустим, что надо исследовать 100 пробирок. Титр комплемента в бактериологической системе 0,3, разведение 1 ; 20. Следовательно, в каждой пробирке чистого комплемента имеется 0,015, т. е, 0,3 :20 ==0,015.

0,015Х100== 1,5 чистого комплемента и 48,5 физиологического раствора.

Антиген применяют в титре, установленном биофабрикой. При получении новой партии титр проверяется на известных сапных и нормальных сыворотках по приведённой ниже схеме.

Главный опыт

Испытуемые сыворотки исследуются в дозе 0,05. Контроля без антигена в дозе 0,1. Инактивируются сыворотки с физиологическим раствором при 58—59° С 30 минут. Время связывания бактериологической системы в водяной бане—20 минут, реакция—20 минут.

Сыворотки, обнаружившие ту или иную степень задержки гемолиза, проверяются вторично в дозах 0,1 и 0,05, с контролем в дозе 0,1.

При массовых исследованиях разрешается производить первую реакцию, с сывороткой без контроля (сыворотки без антигена).

Основные контроли. главного опыта. 1. Нормальные и сапные сыворотки с антигеном и без антигена в дозах 0,05.

2. Антиген в двойной дозе без сыворотки.

3. Контроли гемолитической системы.

4. Оценка результатов реакции.

Официальной диагностической дозой сыворотки, по которой даётся результат, является 0,05 см3 для реакции, производящейся в объёме 0,5 см3. Доза 0,1 см3 является вспомогательно-контрольной. Результат реакции оценивается два раза. Первый раз тотчас после водяной бани, второй—через 12 часов стояния проб при комнатной температуре. Оценка выражается крестами по следующей схеме:

а) положительная реакция ……………………………..++++ +++ ++±

б) сомнительная » …………………………….. ++ +

в) отрицательная » …………………………….. —

Степени задержки, выражаемые крестами, соответствуют следующим процентам гемолиза эритроцитов:

++++ гемолиз эритроцитов ……………………….от 0 до 10%

+++ » » ………………………. » 10 » 40%

++± » » ……………………….. » 40 » 50%

++ » » ………………………… »50 » 70%

+ » » ……………………….. » 70 » 90%

— » » …………………………» 90 » 100%

Результат исследования сообщается словами: положительная, отрицательная, сомнительная реакция, с указанием количества крестов. Данные всех титрационных опытов и особенностей реакции вносятся в дневник серологических работ лаборатории.

Для внесения объективного признака в определение результата реакции крестами и однообразной оценки её в различных лабораториях, рекомендуется производить оценку в процентах гемолиза. Это делают так: из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость сливают в одну пробирку. Жидкость эта означает 100 о/о гемолиза. Из неё готовят разведения с меньшими процентами гемолиза следующим образом:

№ пробирок

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Гемолизированная жидкость

0 2

0 4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Физиологический раствор……… Процент гемолиза. . .

1,8

10

1,6

20

1,4

30

1,2

40

1,0

50

0,8

60

0,6

70

0,4

80

0,2

90

Стандартные пробирки приготовляют перед учётом реакции. Учёт производят тогда, когда эритроциты осели на дно пробирки. Цвет исследуемой жидкости сравнивают с цветом жидкости, находящейся над осадком в стандартной пробирке; процент переводят в кресты.

Для более наглядного сопоставления реакции со стандартной жидкостью гемолиза рекомендуется при изготовлении этого стандарта, не изменяя объёма жидкости, в каждую пробирку добавить кровяных шариков барана в разведении 1 :40 по следующей схеме:

№ пробирок

1

2

3

4

5

6

7

8

9

2,5% взвесь эритроцитов………

0,45

0,40

0,35

0,30

0,25

0,20

0 15

0,10

0,05

Общий объём гемолизированной жидкости.

2,05

2,10

2,15

2,20

2,25

2,30

2,35

2,40

2,45

Титрация сапного антигена

1. Для титрации берут две сапные сыворотки различной силы ( ++++ И ++).

2. Одну нормальную сыворотку.

Сапные сыворотки предварительно разводят следующим образом:

Разведение 10 см3 сыворотки +9,0 см3 физиологического раствора равно 1: 10

0,4 » +9,60 » » » 1:25

0,20 » + 9,80 » » » 1 :50

0,13 » +9,87 » » » 1:75

0,1 » +9,9 » » » 1:100

Комплемент, гемолиэин и эритроциты—в рабочих титрах; температура водяной бани и время— обычные.

Гемолизин.

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Взвесь эритроцитов….

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

20 минут в водяной бане при 38°С.

По этой схеме ставят остальные разведения сыворотки, В случае, если сыворотка даёт +, ++, +++, то достаточно первых трёх разведений.

Нормальную сыворотку берут в (первом и третьем разведении, контроль на антиген, пробирку с антигеном без сыворотки 1 :10.

Примерный результат реакции следующий: (определение произведено в процентах гемолиза и по осадку эритроцитов):

Разведение антигена

1 :10

1 :50

1 :100

1:150

1:200

1 :300

1 :400

1 :500

Разведение 1)

сыворотки 2)

3)

4)

5)

0

0

0

0

0

10

20

40

0

0

10

0

0

10

0

0

10

0

0

0

0

10

10

10

20

40

30

40

60

60

60

100

10

20

20

10

40

100

100

100

Наибольшая задержка гемолиза у сильно разведённых сывороток получилась с разведением антигена 1 :100. Это разведение и является рабочим титром антигена. Титром антигена считается то разведение его, которое даёт наибольшую задержку гемолиза с разведенными сапными сыворотками разной активности.

Антиген должен быть прозрачным. Результаты титрации заносят подробно в лабораторную книгу.

Метки: