Часть 2. Курсовая работа по микробиологии. Тема:«Плазмиды и их роль в жизнедеятельности бактериальной клетки»

Генетическая регуляция.

Внешнее проявление поддержания плазмид в клетках заключается в том, что большинство или все клетки плазмидосодержащей популяции содержат плазмиды. В случае F, RI и RK2 установлено, что они кодируют летальность клеток, потерявших плазмиду, т. к. продукты соответствующих плазмидных убивают клетки, потерявшие их.

Некоторые плазмиды поддерживаются в клетках в количестве 1 – 3 копий на клетку. Они нуждаются для репликации в ДНК-полимеразеIII и их репликация проходит под строгим контролем клетки. Другие – в количестве 40–50 копий и используют ДНК-полимеразу I.

Их репликация проходит под релаксированным контролем. При делении клетки, дочерние получают не менее 1 копии плазмиды. Так как считалось, что они реплицируются на определенной стадии репликации ДНК бактерии, то, вероятно, существуют контрольные механизмы. Было предположено, что плазмиды сами регулируют свою репликацию и распределение, причем система репликации реализуется путем осуществления двух функций, одна и которых определяет среднее количество копий на клетку, а другая отзывается на изменение количества и восстанавливает его до нормы.

Еще в 60-е гг. была предложена гипотеза позитивного контроля. Предполагалось, что плазмида F несет 2 генных локуса, контролирующих процесс. Репликаторный локус (оператор репликации, репликатор) и структурный ген для синтеза диффузабельной субстанции – позитивного инициатора (эффектора) репликации. Контроль синтеза инициатора модулирует частоту инициации. Для объяснения стойкого наследования клетками плазмиды F в рамках этой модели было предположено так же, что она прикрепляется к тому сайту на клеточной мембране, к которому прикрепляется хромосома. В процессе каждого деления клетки происходит удвоение и мембранного сайта, и хромосомы и плазмидной ДНК. Оба образовавшихся комплекса расходятся в дочерние клетки.

В интегрированном в хромосому клетки хозяина состоянии, плазмида теряет самостоятельность репликации, которая теперь происходит вместе с хромосомой хозяина.

В 60-е гг. была выдвинута так же гипотеза негативного контроля. В соответствии с этой теорией было предположено существование негативно действую-щего стойкого ингибитора инициации репликации. Ингибитор кодируется геном, транскрибируемом немедленно после инициации репликации и каждое инициаторное событие сопровождается продукцией ингибитора в количестве, достаточном для подавления любой последующей инициации до момента, когда концентрация ингибитора уменьшится вдвое в связи с делением клетки.

В случае плазмиды colE1, установлено, что ингибитор – нестойкие нетранслируемые молекулы РНКI, которые негативно контролируют образование гибридов РНК-прозатравка – ДНК, т. к. связывается с молекулами прозатравки. В норме молекула РНК-прозатравки соединяется с ее ДНК-шаблоном в районе O-пункта, далее РНК-аза «плавит» прозатравку, давая начало РНК-затравке, на которую потом добавляется дезоксирибонуклотиды. Комплекс же РНКI-РНК-прозатрав-ка выключается из процесса.

Определенное влияние оказывает клетка хозяина. Многие плазмиды для репликации нуждаются в бактериальных ДНК-полимеразах. Репликация плазмиды pRSF2124 нуждается в бактериальных эндонуклеазах, контролируемых генами бактериальной хромосомы.

На количество копий плазмид оказывают влияние вид бактерий, хромосомные гены, культивирование бактерий. Например копийность плазмид pER2 в E. coli выше нежели чем в коринобактериях.

Экспериментальные данные свидетельствуют, что и в контроле распределения участвуют гены хромосомы хозяина.

Конъюгационный перенос.

Процесс контролируется опероном tra. В общем виде он представляет из себя:

Образование конъюгационных пар.

Установление специфичных клеточных контактов.

Перенос начинается с сайта oriT. Перенесенная ДНК может стойко поддерживаться в трансконъюгантах в автономном состоянии либо включаться в хромосомный репликон хозяина посредством рекомбинации.

Долгое время считалось, что конъюгация – исключительно свойство Enterobacteriaceae, однако в последние годы показана ее возможность и у других микроорганизмов. У Enterobacteriaceae и Pseudomonada-ceae конъюгационный перенос обеспечивается тем, что плазмиды контролируют синтез секс-пилей для контактов. У грамположительных бактерий не обнаружены, у некоторых из них контакты между клетками обеспечиваются транспозонами (Streptococcus), фагами (staphylococcus) или экстрахромосомными ферромонами (Enterococcus).

При формировании клеточных контактов наряду с парами образуются агрегаты, в которых насчитывают до 13 скрещивающихся клеток. Эффективность спаривания не зависит от размеров агрегатов. Большинство скрещиваемых клеток способно формировать агрегаты в течение 30 минут, что, как предполагают, — результат роста и деления клеток, установивших контакты.

Способность спариваться клеток-доноров с клетками-реципиентами определяется наличием F-пилей у доноров. Тонкий механизм участия пилей в формировании клеточных контактов не выяснен до конца. Одно из объяснений его заключается в том, что последние – структуры, объединяющие конъюгирующие клетки и представляющие из себя трубки, через которые перемещается плазмида в реципиентную клетку. Другое предположение состоит в том, что, после столкновения двух соответствующих микроорганизмов и установления между ними начального контакта, пили действуют как в качестве крючков, взаимодействуя концом с поверхностью клетки реципиента. После дотрагивания пиля втягивается назад в донорскую клетку, чем обеспечивает контакт между клетками по типу «стенка к стенке». Затем формируется конъюгационная трубка.

Что бы быть компетентной в конъюгации, клетки-реципиенты должны обладать рядом свойств:

Клеточная стенка должна иметь специфические рецепторы.

Клеточная стенка должна пропускать одноцепочечную плазмидную ДНК.

Внешние факторы оказывают большое влияние на конъюгацию бактериальных клеток (состав питатель-ной среды, температура, время культивирования, изменение pH среды: снижение pH от 7.2 до 6.2 ведет к удвоению частоты спариваний).

Плазмидный перенос состоит из ряда стадий:

Инициация ДНК плазмиды.

Разделение цепей переносимой ДНК в клетке доноре. Для этого необходима насечка «надсечка» и раскручивание макромолекулы, что обеспечивается эндонуклеазами клетки – никазами.

Перенос цепи. Он осуществляется в направлении от 5’ к 3’-концу, т. е. 3’-конец – ведущий. Перенос длится 15 – 20 минут.

Конъюгативный синтез в клетке доноре

Репликонация ДНК плазмиды в клетке-реципиете. Репликонация – конвертирование одноцепочечной ДНК плазмиды в двухцепочечную.

Репликонация осуществляется в виде 2-х процессов: синтеза комплиментарной цепи и кольцевания плазмиды. Изучение плазмид F и сol показало необходимость для конъюгационного синтеза в клетках реципиентах ДНК-полимеразы III (для синтеза цепи). ДНК-полимеразе для работы необходима затравка, которую обеспечивает либо РНК-полимераза, либо РНК-примаза.

ДНК плазмид прикрепляется ко внутренней мембране в реципиентных клетках, где она приобретает кольцевую форму после синтеза второй цепи.

Мобилизация – процесс, основу которого составляют метаболические реакции, обеспечивающие подготовку плазмиды к переносу. Мобилизация присуща как конъюгативным, так и неконъюгативным плазмидам. Конъюгативные плазмиды могут мобилизовать на перенос неконъюгативные плазмиды. Это применяется при скрещивание даже очень отдаленным видам. Еще в старых работах было показано, что мобилизация на перенос неконъюгативных плазмид резистентности конъюгативными плазмидами обычно дает трансконъюганты, в которых обе плазмиды сосуществуют физически неизменными, не ассоциированными. Однако в процессе мобилизации могут формироваться и стойкие коинтеграты. Например, исследования мобилизации конъгативных плазмид pRQ1 на перенос неконъюгативных плазмид pRQ2 в клетках S. typhimurium, показало, что она сопровождается формированием коинтеграта плазмид pRQ6. Коинтегративный характер последних был подтвержден тем, что эта плазмида имеет резистентности обеих исходных, ее перенос термозависим, как pRQ1, и она несовместима с обеими исходными.

Существуют плазмиды, которые проявляют конъюгативные свойства лишь в присутствии реципиентных клеток, синтезирующих секс-ферромоны – низкомолекулярные полипептиды. Такие плазмиды установлены в клетках некоторых штаммов E. Faecalis. Они детерминируют лекарственную резистентность, гемолизины, бактериоцины и др. Ответ донорских клеток на ферромоны — через 20-30 минут. Он заключается в синтезе белковой фибриллярной иммунологически активной субстанции – адгезина – на поверхности клеток, что обеспечивает формирование агрегатов бактерий. Разным плазмидам соответствуют разные ферромоны.

Механизмами, ограничивающими перенос, являются поверхностное исключение, которое снижает вероятность переноса 100-300 раз и детерминируется плазмидными генами traS traT и неэффективность пилей. Кроме того, существуют ограничения, действующие после проникновения плазмид в клетки, так в результате изменения экспрессии плазмидных генов, клетки иногда не получают донорских свойств, плазмиды могут разрушаться рестриктазами, кодируемыми внутриклеточ-ным генетическим материалом (предполагают, что конъюгативные хромосомы с широким диапазоном переноса обладают генами с антирестрикционными функциями. Важными механизмом является летальный зигозис.

Свойства бактерий, контролируемые плазмидами.

Плазмиды лекарственной резистентности.

Общая характеристика и механизмы действия.

По данным японских исследователей, первый случай выделения бактерий, устойчивых к нескольким лекарственным веществам с различными механизмами действия, был отмечен в 1955 г. в клинике при обследовании женщины, больной дизентерией. От нее была выделена шигелла, устойчивая к действию сульфамидов, стрептомицина, хлорамфеникола и тетрациклина. Вскоре после этого в 1956 г. было выделено большое количество дизентерийных штаммов, обладавших резистентностью к тем же четырем лекарственным веществам, причем во многих случаях лечение проводилось лишь одним из них. Вслед за японскими работами появились сообщения о множественной резистентности, выявленной у других представителей семейства энтеробактерий и стафилококков. Японские ученые доказали возможность передачи всего комплекса устойчивости от его носителей к чувствительным бактериям. Для обозначения комплекса генетических детерминантов множественной лекарственной устойчивости японские исследователи предложили символ R.

R-плазмиды детерминируют резистентность бактерий к лекарственным веществам – главным образом антибио-тикам и сульфаниламидам. В широком плане к плазмидам резистентности относят плазмиды, кодирующие резистентность бактерий к бактериофагам, бактерио-цинам, сыворотке, ионизирующему излучению, тяжелым металлам и др. Наиболее полно изучены R-плазмиды грамотрицательных бактерий. Большинство из них конъюгативные, а R-плазмиды грамположительных – неконъюгативные.

Большинство генов устойчивости транспозонного происхождения. Их отличительная особенность в том, что они включаются в определенных местах. Такие последовательности именуются интегронами, а их носителями являются обычно транспозоны.

ДНК R-плазмид представлена в виде ковалентно закрытых кольцевых молекул, предположительно в суперспирализированной форме.

Молекулярная масса, копийность

И другие свойства некоторых R-плазмид.

Плазмида Молек. масса Организм Копийность
R1 65 E. coli 1
R6 65 E. coli 1
R6K 26 P. mirabilis 13 — 38
R100 75 P. mirabilis 13 — 38
RR4 40 P. mirabilis 1 – 3
SuSm 5 — 6 E. coli 5,8 — 8
PSC101 5,6 E. coli 6
RSF1030 8,3 E. coli 6
RSF2124 7,4 E. coli 10

Резистентность бактерий, содержащих R-плазмиды, обычно зависит, от вида бактерий и типа антибиотиков. Например, клетки E. coli в большинстве устойчивы к стрептомицину при его концентрации в среде 10 — 25 мкг/мл, тогда как шигеллы – при концентрации 10000 мкг/мл, сальмонеллы резистентны к тетрациклину при концентрации 10 мкг/мл, тогда как шигеллы – при концентрации 100 – 250 мкг/мл.

Для плазмидных детерминантов резистентности часто характерно повышенная экспрессивность. Повышение копийности плазмид в результате мутаций генов репликации сопровождается значительным повышением уровня резистентности и подчиняется закономерности «доза-эффект». Повышении экспрессии плазмидных детерминантов лекарственной устойчивости может происходить также и посредством других механизмов: амплификация, приобретение множественных копий транспозонов, повышение интенсивности транскрипции генов.

При смешанном культивировании бактерий различной видовой принадлежности возможен межродовой перенос некоторых плазмид. Например, S. typhimurium ® V. cholerae, S. marcescens ® Y. pestis, P. aeruginosa ® E. coli.

В результате систематического мониторинга лекарственной резистентности кишечных бактерий разных видов, предпринятого в 60-х гг. в Японии, были получены результаты, свидетельствующие, что клетки

~ 58% штаммов, устойчивых к тетрациклину, канамицину, стрептомицину, сульфаниламидам, содержат плазмиды. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что и конъюгативные и неконъюгативные R-плазмиды, детерминирующие резистентность к антибиоти-кам и сульфаниламидам, присутствуют в бактериях многих видов, в разных зонах мира.

Лекарственная резистентность энтеропатогенных штаммов E. coli, выделенных в Англии в 1980-81 гг.

Лекарственные вещества Концентрация мд/л К-во резистентных штаммов (%)
Пенициллин 8 37,1
Хлорамфеникол 8 12,5
Фурозолидол 20 0,4
Гентамицин 4 0
Налидиксовая к-та 20 0
Неомицин 8 9,1
Стрептомицин 16 45,7
Сульфонамиды 100 45,7
Тетрациклин 0,5 6

Всего 232 штамма, из них 134 – с резистентностью, а 65 – с трансферрабельной резистентностью.

Исследование 24 энтеропатогенных штамма E. coli, выделенных от больных людей и домашних животных в 70-е гг. в СССР показало, что 16 из них являются резистентными к 1 или более антибиотиков, чаще всего к стрептомицину, тетрациклину, канамицину. В клетках 9 штаммов были конъюгативные плазмиды.

Возрастание частоты резистентности и встречаемости в резистентных штаммах R-плазмид происходит по мере использования антибиотиков и др.

Значительный рост резистентности, обусловленный плазмидами, отмечается у стрептококков, причем частота зависит от антибиотика. Например, большинство выделенных в Японии S. pyogenes резистентны к 1 — 2 антибиотикам, более 50% штаммов резистентны одновременно к тетрациклину, эритромицину и хлорамфениколу. Резистентность к тетрациклину особенно часто встречается среди стрептококков этого вида, групп B, D. Для многих штаммов S. pneumonie показана множественная лекарственная резистентность.

Возрастание частоты резистентности четко видно на стафилококках (S. aureus) – частых возбудителей внутригоспитальных инфекций.

После открытия пенициллина, период эффективной пенициллинотерапии был очень коротким, т. к. уже к 1946 г. госпитальные штаммы были на 50% резистентны к нему. В начале 60-х гг. были введены в практику метециллин и оксациллин, бывшие достаточно эффективными до конца 60-х гг.

Начиная с 50-х гг., начиная с США, стали выделять штаммы одновременно резистентные и к пенициллину, и к стрептомицину, хлорамфениколу и эритромицину. Неомицин-резистентные штаммы стафилококков появились в 1959-60 гг., а через 10 лет развилась резистентность к родственным антибиотикам: канамицину и парамицину. В 1976 г. были зарегистрированы внутригоспитальные вспышки, вызванные стафилококками, резистентными и к гентамицину и др. аминогликозидам. В этом же году появились сообщения о выделении стафилококков, резистентных и к гентамицину и метициллину, но и к пенициллину и стрептомицину, выделенных в Мельбурне, Лондоне, Дублине и США.

Как выяснилось, плазмиды могут участвовать в формировании хромосомной резистентности в качестве векторов транспозируемых генетических элементов.

Частота, с которой появляются резистентные бактерии в среде очень высока. Поскольку лекарственные вещества и кормовые антибиотики используются в ветеринарии и растениеводстве, то распространение селекционированных резистентных организмов от одного к другому хозяину, а так же от животных к человеку имеет важное эпизоотическое и эпидемиологическое значение.

Механизмы лекарственной резистентности.

Лекарствен-ное в-во Мишень Механизм ре-зистентности Продукт плазмиды
Пенициллин Клеточная стенка; Ингибирует ферменты, отвечающие за синтез клет. стенки 1.Ферментатив-ная инактива-ция.2.Снижение количества или родства пенициллина.3.Толерантность к бактерицид-ным эффектам антибиотиков B-лактамаза
Хлорамфени-кол Рибосома. Ингибирование синтеза транспептидазы 1.Инактивирова-ние антибиотика ацетилирование его OH групп.2.Изменения в транспорте антибиотиков Ацетилтранс-фераза.
Макролиды(эритромицин, олеандомицин) и линкозамиды(линкомицинКлиндамицин стрептограмин B) Рибосома. Ингибирование синтеза белка Изменение рибосомыN6 – диметил-лирование аденинового остатка в pPHK) Метилаза
Сульфонамиды Конкурентное ингибирование дигидро-птероатсин-тетаза 1.Замещение фермента чувствительного к сульфонамиду2.ИзмененияВ транспорте Дигидроптеро-атсинтетаза, резистентная к сульфонамиду
Триметоприм Конкурентное ингибирование дигидрофолат-редуктазы. Сверхпродукция дигидрофолат-редуктазы. Дигидрофолат-редуктаза резистентная к триметоприму.
Тетрациклин Рибосома. Ингибирование синтеза белков. Изменения в транспортеАнтибиотикаEfflux-механизм. ИндуцибельныеTet-белки.
Аминоглико-зиды:
Стрептомицин Рибосома. ИнгибируетСинтез белковМембраны. Изменения вСтруктуреРибосом.Модификация антибиотикаФерментами. Аминоглико-Зидфосфа-трансферазаАктивный ацетил.
Спектиномицин -//- Изменения в транспорте антибиотика N-ацетилтранс-феразаO-фосфотранс-феразаO-нуклеотид-Трансфераза.
Неомицин, канамицин,Гентамицин и др. -//- -//- O-аденилтранс-фераза.Ацетилтранс-Фераза.
Фузидовая кислота. Ингибирование фактора элон-гации в бел-ковом синте — зе на уровне рибосомы. Непроницаемость клетки для антибиотиков. Ацетилтранс-фераза.

Ферментативная инактивация антибиотика происходит в среде за пределами клетки. Одиночные клетки поэтому беззащитны. Ферменты b-лактамазы инактивируют

B-лактамные антибиотики путем гидролиза еще до того, как они успеют проникнуть через клеточную мембрану и достичь пенициллинсвязывающих белков в ЦПМ.

Изменение сайтов-мишеней в качестве механизма резистентности показаны с случае многих антибиотиков. Однако прямое отношение доказано лишь в случае эритромицина и линкомицина. Механизмы резистентности к этим антибиотикам заключаются в специфическом N6-диметилировании 2-х адениновых остатков в рРНК, в результате чего, такие рибосомы в значительно меньшей степени связываются с антибиотиком (такое связывание привело бы к ингибированию белкового синтеза).

Efflux-механизм характерен для резистентности к тетрациклинам. Он связан с удалением из клетки этого антибиотика. Не исключено, что пониженное действие тетрациклина связано как с пониженным его восприятием клеткой, так и с efflux-механизмом.

Обходные механизмы лежат в основе плазмидной резистентности к сульфонамидам и триметоприму. Плазмиды обеспечивают клетки новым ферментом, заменяющий подавленный и нечувствительный к ингибирующему действию антибиотика.

Кроме всего перечисленного плазмиды определяют также и резистентность к тяжелым металлам и др.

Резистентность к ртути и ртутьорганическим соединениям. Токсичность ионов ртути для бактериальной клетки определяется тем, что они очень легко связываются с сульфгидрильными группами мембранных белков и ферментов, ингибируя синтез макромолекул и др. действия ферментов.

Резистентность к кадмию, который, связываясь с сульфгидрильными группами мембранных белков, прекращает клеточное дыхание.

Резистентность к серебру (действует в том же направлении, что и кадмий).

А также ко многим другим веществам (медь, висмут,

Свинец, бор, хром, кобальт, никель, соединения цинка).

Мутации внехромосомных

Факторов резистентности.

Эписомные элементы (плазмиды), обладающие способностью поддерживать собственное автономное состояние и независимость скорости репликации от регуляторных механизмов клетки-хозяина, также независимо могут мутировать, либо не влияя на поведение бактериальной клетки, либо в какой-то мере изменяя ее физиологические функции.

Обычно принято считать, что эписомные детерминанты контролируют невысокую резистентность; однако в действительности имеется немало наблюдений, противоречащих такому представлению. Наблюдался четко выраженный мутаторный эффект у штамма Salmonella typhi, выделенного от больного; штамм этот характеризовался наличием разных типов R-факторов: Sin, Тс, только Тс, или Тс, Sm. Культуры бактерий Salmonella typhi, Salmonella typhimurium и E. coli, инфицированные этими факторами, проявляли генетическую нестабильность и мутабельность детерминантов резистентности к высоким концентрациям антибиотиков. Высокая резистентность передавалась реципиентам при последующей конъюгации со скоростью, типичной для трансмиссивных элементов. Внехромосомная локализация детерминантов, контролирующих высокую резистентность, подтверждалась возможностью их элиминации. Генетический анализ мутаций у полирезистентных штаммов довольно сложен прежде всего потому, что в них могут сосуществовать независимые друг от друга комплексы детерминантов резистентности со своими автономными факторами передачи, и каждый такой комплекс может видоизменяться в результате разнообразных событий — мутаций, сегрегации или рекомбинаций. Фенотипическое выражение подобного рода изменений в состоянии генома бактериальной клетки часто взаимно маскируется и с трудом поддается дифференцированному тестированию.

Часто имеет место мутационное изменение генов, контролирующих репликацию самого фактора резистентности в естественных условиях. Такие мутации могут увеличить копийность плазмиды, что часто усиливает резистентность к большим концентрациям лекарственных и других веществ.

Иногда в мутациях затрагиваются регуляторные механизмы, контролирующие проявления конъюгативности бактерий. При этом может, например, сниматься репрессия донорской активности.

Роль бактериального генома у сальмонелл нередко проявляется в ограничении функций внехромосомных элементов, в том числе и факторов трансмиссивной устойчивости к лекарственным веществам. Известно, например, что сальмонеллы обладают низкой реципиентной активностью. R-факторы воспринимаются ими, как правило, с незначительной частотой, что связывается с ограничением, контролируемым клеткой-хозяином. Под влиянием мутагенов можно получить мутанты R-факторов, способные преодолевать это ограничение. Такие мутанты были получены путем воздействия нитрозогуанидина на Salmonella typhimurium c R-фактором дикого типа; способность R-мутантов преодолевать ограничения представляется функцией, независимой от реципиентных свойств бактерии-хозяина.

Мутации по устойчивости к хлорамфениколу наблюдали еще в 1969г. у штамма Klebsiella c устойчивостью к пяти антибиотикам. При конъюгации маркеры резистентности передавались реципиентам из различных систематических групп грамотрицательных бактерий — эшерихий, шигелл, протеев и др., а также путем трансдукции с фагом Рlс из E. coli. Проявление мутационного эффекта только в отношении резистентности к одному антибиотику свидетельствует об индивидуальной генетической реакции отдельных детерминантов резистентности на воздействие мутагенов.

Это далеко не исчерпывающее описание возможных мутаций, котрых у плазмид может наблюдаться огромное множество.

Элиминация R-факторов.

Лекарственная устойчивость бактерий, детерминируемая трансмиссивными генетическими элементами, представляет серьезную угрозу ее неограниченного распространения, принимающего масштабы подлинной «пандемии» в микро мире, связанной с экологией человека и животных. Поэтому в настоящее время придается чрезвычайно важное значение исследованиям, направленным на изыскание путей предотвращения или по крайней мере существенного ограничения распространения лекарственной устойчивости у бактерий, составляющих микрофлору нестерильных полостей макроорганизма — человека, животных, птиц и даже возможных переносчиков бактериальных возбудителей инфекции.

Многими исследователями было замечено, что признаки устойчивости к лекарственным веществам у грамположительных и грамотрицательных бактерий, контролируемые внехромосомными детерминантами, нередко утрачиваются спонтанно или закономерно исчезают после обработки определенными соединениями, обладающими избирательной ДНК-тропностью. Этот феномен, обозначаемый термином «элиминация», связанный с утратой генетических детерминантов, в том числе плазмид и факторов резистентности, используется как одно из доказательств их внехромосомной локализации.

Изучение сущности и механизмов этого явления представляет большой не только теоретический, но и практический интерес, хотя до настоящего времени не удалось еще достигнуть такого эффекта элиминации, чтобы его можно было использовать в клинических целях. Задача поиска эффективных средств элиминации эписомных детерминантов резистентности осложняется, еще и тем обстоятельством, что большинство известных элиминирующих соединений является либо мутагенами, либо, кроме того, и канцерогенами, что налагает дополнительную ответственность на испытателей при оценке эффективных средств и практических рекомендаций. В качестве элиминирующих агентов наиболее широко используются при теоретических исследованиях акридиновые красители (акрихин, акридиновый оранжевый). При элиминации происходит необратимая утрата генетических элементов, локализованных вне хромосомы.

Механизмы, лежащие в основе элиминирующего действия акридиновых красителей, во многом остаются нерасшифрованными, однако методами генетического анализа четко показано, что при действии акридинов на бактерии, обладающие трансмиссивной резистентностью к антибиотикам, происходит полное подавление генетических и физиологических функций ее детерминантов. возможно, элиминация связана с блокированием репликации эписом либо нарушения участка ее инициирования, либо из-за нарушения прикрепления эписомных реплик к центрам бактериальных мембран, отвечающих за сегрегацию генетического материала в дочерних клетках.

Novick (1963) показал, что спонтанные пенициллиночувствительные варианты стафилококка с полной утратой пенициллиназной активности не мутируют ни спонтанно, ни после обработки мутагенами в направлении восстановления устойчивости к пенициллину. Эти же формы не дают и рекомбинантов дикого типа при скрещивании друг с другом, а также с мутантами, сохранившими низкий уровень образования этого фермента.

Факторы трансмиссивной резистентности к лекарственным веществам, как отмечено ранее, ведут себя подобно другим внехромосомным элементам, которые в автономном, состоянии могут быть подвержены эффективному действию элиминирующих агентов. Поэтому некоторые общие положения, выявленные на других системах, могут быть приняты и для резистентных бактерий.

Отсутствие эффекта полной элиминации определенных внехромосомных детерминантов может быть следствием того, что в одной клетке имеется несколько различных R-факторов с различными наборами генов резистентности.

Помимо акридиновых красителей, за последнее время выявлены другие соединения с высокой элиминирующей активностью. Одним из таких соединений оказался бромид этидиума. Показано, что это соединение в низких концентрациях (5 ¸ 10 * Ю6 М, рН 7,2) вызывало у энтеробактерий практически полную элиминацию факторов R4, R22, в то время как другие, хорошо передающиеся при конъюгации факторы (R15 и R8) не элиминировались вообще. Причина, лежащая в основе этого различия, пока остается невыясненной. У стафилококков с пенициллиназной активностью также удалось с довольно высокой эффективностью (8—100%) освобождать клетки от плазмид, причем устойчивость к сулеме и образование пенициллиназы утрачивались одновременно, но без потери устойчивости к эритромицину. Примечательно, что на пенициллиназных плазмидах Staphylococcus aureus может находиться детерминант, определяющий устойчивость к этому препарату. Другим высокоактивным препаратом оказался додецилсульфат натрия, который не только приводил к элиминации R-факторов, но и вообще был более токсичен по отношению к R+ — клеткам, чем к клеткам без R-факторов. Это служит еще одним примером лекарственной конверсии клеток. Аналогичным действием обладал 4-нитрохинолин-1-оксид.

С действием додецилсульфата натрия можно также сравнить действие пенициллина, который в суббактериостатических концентрациях вызывает устранение R-факторов из клеток Salmonella paratyphi (R)

В качестве элиминирующих агентов может выступать большое число соединений, в том числе и такие, которые являются естественными метаболитами (гуанин, глюкоза и некоторые детергенты освобождают клетки Staphylococcus aureus от плазмид с пенициллиназной активностью).

Большое число работ касается данных об элиминирующем действии повышенной температуры на культуры стафилококка с пенициллиназной активностью. Отмечается, что условия повышенной температуры вызывали не только появление негативных вариантов, но и селективно способствовали более быстрому росту последних.

Нужно учесть, что некоторые элиминирующие химические агенты в определенных концентрациях могут не только вызывать утрату устойчивости, но в силу своего мутагенного потенциала могут индуцировать ее в некоторых случаях. Учитывая, что все акридины являются в определенных условиях мутагенами, нельзя исключить подобный эффект, особенно при анализе свойств одномаркерных факторов резистентности, где фенотипическое выражение «элиминация» в действительности может отражать мутационное изменение, характеризующееся повреждением генов, контролирующих чувствительность к определенному веществу.

Лекарственная конверсия.

Детерминанты устойчивости вызывают в клетках бактерий изменения, затрагивающие самые разнообразные признаки и известные в литературе как проявление «лекарственной конверсии». Приводятся сведения о более высокой выживаемости бактериальных клеток, инфицированных некоторыми R-факторами, поле УФ-облучения. Лекарственная конверсия может затрагивать также фаготип сальмонелл

как при эписомной, так и хромосомной локализации детерминантов устойчивости и влиять на эффективность развития большого числа фагов в клетках E. coli К12 как с fi+, так и с fi — R-факторами

Б. А. Шендеров (1970), исследовавший активность некоторых оксидоредуктаз дизентерийных бактерий (Shigella flexneri и Shigella Sonne), воспринявших R-факторы в опытах in vitro от E. coli, отмечал у них повышение каталазной и пероксидазной активности. Само по себе присутствие плазмиды резистентности сообщает клеткам высокую чувствительность к названным препаратам. В то же время замечено, что, R-фактор, по-видимому, сообщает клеткам и более высокую мутабельность по резистентности к лекарственным веществам.

Сейчас все же приходится констатировать, что работ, отражающих существенный прогресс в изучении путей предотвращения или ограничения распространения множественной лекарственной устойчивости бактерий, еще очень мало.

Продление чувствительности к лекарствам.

Упорядочивание использования антибиотиков и строгий контроль.

Прекращение использования клинически ценных антибиотиков в качестве кормовых добавок.

Поиск ингибиторов на ингибиторы действия лекарств.

Поиск новых антибиотиков, резистентных к ферментам плазмид.

Плазмиды бактериоциногении.

Бактериоцины – вещества, летальные для клеток бактерий. Их названия определяются названиями микроорганизмов-продуцентов. Это термостабильные белки, массой от 10000 до 90000 дальтон.

Плазмиды колициногении (col) наиболее изучены. Они содержатся в 20% штаммов E. coli. Колицины подразделяют на группы: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, S1, S2, S3, S4, S5, V. Группа E делится на E1, E2, E3 и тд. E1 вносит непоправимые изменения в цитоплазматическую мембрану. E3 разрушительно воздействует на рРНК, E2 вызывает деградацию ДНК.

Плазмиды тоже делятся на 2 группы: I (col E1, col E2, col E3, …E4, …E5, …E6, …E7, …E8, ..E9, col N, col K, col A) и II (col Ib, col B, col V)

Среди плазмид колициногении встречаются как конъюгативные, так и неконъюгативные. Некоторые способны мобилизовать хромосомные гены. Все плазмиды колициногении постоянно находятся в автономном состоянии.

Колицины действуют только на близкие по виду клетки, адсорбируясь на специальных рецепторах на их поверхности. Для того, чтобы убить чувствительную клетку достаточно нескольких молекул колицинов.

Бактериоцины продуцируются и другими клетками. Так Bacillus megaterium продуцируют три вида мегатериоцинов: A, B, C.

Плазмиды и патогенность бактерий.

Патогенность – комплексный полигенный (мультифакторный) признак бактерий, представляющий собой биохимические механизмы, посредством которых бактерия вызывает болезнь макроорганизма. В любом случае участие в патогенности принимают плазмиды.

Атрибуты патогенности.

Способность к адгезии (позволяет конкурировать с бактериями-комменсалами за колонизацию эпителиальных поверхностей). Обеспечивается адгезинами и клеточными рецепторами. Бактериальный адгезин – белковая структура, на поверхности клетки бактерии. Он взаимодействует с рецептором соматической клетки. В качестве адгезинов часто выступают обычные пили или фимбрии.

Факторы инвазивности — гемолизины, гиалуро-нидаза, протеаза, ДНК-аза, лецитиназа.

Антифагоцитарные свойства – капсула и др.

Токсины.

Плазмиды и патогенность E. coli.

Характерная особенность клеток энтеропатогенных штаммов E. coli в том, что они способны к колонизации на поверхности кишечника, покрытой эпителием и обычно свободной от бактерий. Колонизация обеспечивается адгезией. Клетки этих штаммов обладают антигенами K, и способность к колонизации связана с наличием поверхностного К-антигена – белковых фимбрий.

Антиген адгезии у E. coli в разных серогруппах.

Адгезин O-серогруппа Источник
K88 08,045,0138,0141,0149,0157 Поросенок
K99 08, 09, 020, 0101 Теленок, овца
K99 064,0101,015,025,063,078 Порос., человек
CFAII 06, 08 Человек
F41 09, 0101 Теленок
987P 09, 020, 0141 Поросенок

Для бактерий энтеропатогенных и непатогенных штаммов характерно наличие фимбрий, вызывающих гемагглютинацию эритроцитов. Фимбрии I типа позволяют бактерии прикрепляться к эритроцитам, лейкоцитам, эпителиальным клеткам и др. Они вызывают гемагглютинацию, ингибируемую D-маннозой. Фимбрии другого типа есть только у энтеропатогенных штаммов. Они обеспечивают специфическую адгезию на клетках эпителия кишечника и специфичны для видов эритроцитов, подвергающихся гемагглютинации, которая не ингибируется D-маннозой.

То, что адгезия бактерий энтеропатогенных штаммов действительно контролируется плазмидой, было доказано в эксперименте. Было показано, что E. coli E2348/69 содержат плазмиду адгезии. После элиминации последней, бактерии теряли способность к адгезии. А при введении этой плазмиды обратно в клетки способность восстанавливалась.

Энтеротоксигенные штаммы рассматриваемых эшерихий способны продуцировать LT и St токсины. Lt – термолабильный, ST – термостабильный. Плазмиды Ent контролируют их синтез. Многие из этих плазмид – F-подобные. Токсин LT детерминируется плазмидой, распространенной среди E. coli, вызывающих диарею у людей. А ST – у человека и животных. Плазмиды, детерминирующие синтез обоих токсинов встречается у O-серогрупп: 06, 08, 015, 020, 025, 063, 078, 0115, 0128, 0148, 0159. Фенотип LT+ST часто коррелирует с наличием факторов колонизации.

Связь между токсигенностью и

Наличием антигенов колонизации.

K-антиген Энтеротоксин
ST LT ST+LT
K87 + + +
K99 +
CFAI + + +
CFAII +
38FP +
F41 +

Хотя корреляция токсигенной и гемолитической активности (детерминируемой плазмидой Hly) отмечалась многими исследованиями, большого значения гемолитическим свойствам не придавалось. В лаборатории Кудлай Д. Г. были получены данные, свидетельствующие о том, что введение фактора Hly увеличивает патогенность бактерий (это было доказано методом внутрибрюшинного введения белым мышам токсигенных E. coli до и после инфицирования бактерий плазмидой Hly). Многие клетки Hly+ в той или иной степени токсигенны, хотя однозначной зависимости нет. Передача непатогенным E. coli J62 Hly сообщала им способность вызывать дермонекрозы у кроликов. Патогенность бактерий Hly+ вероятно вызвана не самой способностью вырабатывать гемолизины, а тем, что эта плазмида также детерминирует синтез некоторых токсических веществ (гемотоксинов).

Весьма неприятны случаи комбинированных плазмид, контролирующих и R-признаки и токсигенность, т. к. штаммы, обладающие обусловленной ими токсигенностью, будут распространяться в условиях, когда часто использование антибиотиков в качестве кормовых добавок. Большинство штаммов E. coli, выделяемых при уроинфекциях, менингите, перитонитах и бактериемиях обладают вирулентными свойствами, контролируемыми такими плазмидами. В клетках E. coli, выделяемых при госпитальных инфекциях, обнаруживаются с большой частотой плазмиды Col. Col V обеспечивает повышение вирулентности, резистентность к бактерицидному действию крови. Плазмиды R могут повышать резистентность к сыворотке крови (R6-5). R100 отрицательно влияет на формирование комплемента.

Бесконтрольное использование антибиотиков может привести к селекции и распространению бактерий, обладающих не только резистентностью, но и вирулентностью.

Плазмиды и патогенность других бактерий

Бактерии родов Shigella и Salmonella – инвазивны. Факторы инвазивности детерминируются соответствующими плазмидами. Наличие R-плазмид в них сильно повышает их вирулентность. Переживание в инфицированных соматических клетках обеспечивается у шигелл синтезированием плазмидного гемолизина. В случае сальмонелл установлено, что плазмиды – обитатели наиболее патогенных штаммов. Считают, что плазмиды не нужны для инвазии соматической клетки, они необходимы для пролонгированного переживания сальмонелл в клетках.

Бактерии рода Yersinia – инвазивные. Их вирулентность определяется плазмидой pYV, которая имеет несколько вариантов.

Доказано, что продукция энтеротоксина S. aureus контролируется внехромосомным генетическим элементом. Показан плазмидный контроль их эксфолитивного токсина (кожный синдром у новорожденных). Устойчивость к антибиотикам обеспечивает эпидемичность распространения.

У стрептококков плазмиды контролируют:

Конъюгативную активность.

Резистентность к лекарственным веществам.

Гемолизины

Бактериоцины и чувствительность к ним.

Утилизация углеводов (лактоза, сахароза)

Синтез М-белка

Из рассмотренного видно, какую большую роль играют плазмиды в существовании бактерий и, следовательно, человека.

Актуальные задачи генетики микроорганизмов в настоящее время невозможно представить без систематического изучения роли и механизмов действия внехромосомных факторов наследственности. Исследование генетической природы, молекулярной структуры и регуляции функций плазмид представляет собой одну из фундаментальных проблем современной биологии.

Популярность внехромосомных факторов наследственности микроорганизмов в качестве экспериментальной модели для исследований в разных аспектах объясняется широтой распространения явлений, контролируемых ими и не укладывающихся в рамки хромосомных мутаций, относительной простотой методических приемов идентификации внехромосомных элементов, неограниченной возможностью манипуляций с целью генетического моделирования и четкостью результатов физико-химического анализа их структуры и физиологических функций.

Перспектива использования плазмид и эписом в

связи с их исключительной биологической пластичностью оценивается молекулярными биологами трезво и

объективно. Интенсивно ведется изучение в области

генной инженерии. Исследователи отчетливо понимают

сложность таких исследований, которые могут привести

к непредсказуемым результатам. Природа может

«отомстить» за слишком свободное вмешательство в ее

секреты. Именно поэтому важно знать диапазон природных вариаций в формировании заведомо вредных

для человека форм микроорганизмов, условия, способствующие стабилизации вновь создаваемых биологических систем или ограничивающие ее.

Объективное представление об истинном значении в

этих процессах конъюгативных плазмид, эписом, умеренных фагов и полноценных вирусов бактерий можно получить только с учетом особенностей их экологии, для которой типично формирование стабильного микробиоценоза в нормальных условиях обитания организма.

Представляется оправданным более широкий фронт исследований, направленных на изучение взаимодействия плазмид с целью создания стабильных генетических систем, обеспечивающих более высокую конкурентоспособность (приживляемость в условиях живого организма) обладающих ими бактерий хозяев.

Вполне реально конструирование штаммов-продуцентов, несущих целенаправленные сочетания дерепрессированных плазмид со свойствами специфического ингибирования репликации и передачи факторов патогенности. По-видимому, в недалеком будущем на повестку дня станет создание комплексных бакпрепаратов, соответствующих задачам коррекции определенного типа микробиоценоза и дисбактериозов, сопряженных с периодическим доминированием условно патогенных и патогенных микроорганизмов.

Такие задачи естественно возникают при анализе

замкнутых экосистем, а также при разработке теоретических проблем эволюции микроорганизмов.

Список использовавшейся литературы:

Д. Г. Кудлай «Внехромосомные факторы наследственности и их значение в инфекционной патологии» Москва, «Медицина», 1977 г.

Д. Г. Кудлай, В. Ф. Чубуков, М. Г. Оганесян «Генетика лекарственной устойчивости бактерий» Москва, «Медицина», 1972 г.

З. А. Шабарова, А. А. Богданов, А. С. Золотухин «Химические основы генетической инженерии» Москва, издательство МГУ, 1994 г.

«Лекарственные средства» Москва, «Русская книга»,1993 г.

Пехов А. П. «Основы плазмидологии» Москва, издательство Российского Университета Дружбы Народов, 1996 г.

«Микробиология» 1992 №4 Лукин С. А., Прозоров А. А. «Конъюгационный перенос плазмидной ДНК между бактериями в почве».

Канапина А. Ш. «Изучение природы плазмид B. subtilis» Москва, РАН Институт Общей Генетики имени Н. И. Вавилова, 1995 г.

«Молекулярная генетика, микробиология, вирусология» 1994 №5 Петровская В. Г., Бондаренко В. Н. «Роль хромосомы и ее взаимодействие с внехромосомными детерминантами в процессе генетического контроля патогенности бактерий».

НАЧАЛО —  Курсовая работа по микробиологии. Тема:«Плазмиды и их роль в жизнедеятельности бактериальной клетки»

Метки: