Техника изготовления гистологических препаратов

Изготовление гистологических препаратов включает: 1) фиксацию материала; 2) приготовление гистологических срезов; 3) окрашивание срезов.

ФИКСАЦИЯ МАТЕРИАЛА

Общие сведения. Сущность фиксации заключается в том, чтобы сохранить взятые кусочки органов и тканей от гниения и ферментативных процессов, изменяющих структуру тканей.

Фиксируемые ткани претерпевают ряд физико-химических изменений. Наиболее существенными из них являются: быстрое свертывание белков и отчасти липоидов и переход их в такое состояние, при котором ткани не изменяются от длительного хранения и во время последующих обработок.

Фиксацию тканей производят в жидкостях различного состава. Наиболее употребляемыми являются формалин, спирт, реже ацетон, сулема и др.

Фиксация формалином. Продажный формалин (40%-ный водный раствор формальдегида) применяется в 10%-ном, 15%-ном растворе (10,0—15,0 продажного формалина на 90,0—85,0 воды). Формалин в указанной концентрации сравнительно быстро (48— 72 ч) пропитывает ткань и хорошо фиксирует ее. Нельзя фиксировать материал в растворе формалина более высокой концентрации или в неразведенном продажном формалине. В этом случае поверхностные слои ткани быстро уплотняются, образуют корочку, которая препятствует проникновению фиксирующей жидкости вглубь, где процессы аутолиза могут продолжаться.

В связи с тем, что в формалине всегда содержится какое-то количество муравьиной кислоты, которая может оказать отрицательное воздействие на ткань и помешать некоторым методам дальнейшей обработки материала (серебрение и др.) его следует нейтрализовать мелом. На 100 г продажного формалина (40%-ный раствор формальдегида) прибавляют Юг мела. Содержимое несколько раз взбалтывают, затем дают отстояться, пока мел осядет на дно посуды. Следует также иметь в виду, что при хранении формалина в холодном помещении формальдегид способен к .полимеризации и выпадению из крепких растворов в виде белых осадков. В целях предупреждения этого рекомендуют хранить формалин в теплом помещении, в темной посуде.

Кусочки ткани, взятые для гистологического исследования, не должны быть толще 0,5—0,7 см. Чтобы кусочки ткани не прилегали плотно к стенкам банки, их кладут на вату или фильтровальную бумагу. Объем фиксирующей жидкости должен превышать примерно в 10 раз объем взятого материала. Фиксация водным раствором формалина нежелательна в тех случаях, когда исследование ткани имеет целью обнаружение веществ, растворимых в воде.

В случаях, когда требуется быстрое исследование, кусочки ткани фиксируют в формалине, нагретом до 85—90° С. Продолжительность фиксации кусочков толщиной 2—3 мм при такой температуре 10—15мин. При длительном хранении материала; в формалине в фиксируемой ткани образуются темно-бурые осадки, которые загрязняют препараты. Для удаления осадков рекомендуется опускать гистологические срезы в 2—3%-ный раствор перекиси водорода или в 1%-ный раствор едкого кали, затем их несколько раз промывать водой.

Фиксация спиртом. Этот метод целесообразен только в тех случаях, кргда необходимо зафиксировать в тканях вещества, растворимые в воде и водных растворах фиксаторов. Для фиксации применяют спирт 95 или 100°. Спирт, извлекая воду из кусочков ткани, сам разбавляется и делается менее крепким. Поэтому рекомендуется менять спирт несколько раз. Кусочки ткани при фиксации спиртом должны быть толщиной 2—3 мм. В зимнее время рекомендуется применять спирт-формалин (спирта 70°—90,0, формалина 10,0).

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ

Общие сведения. Для изготовления гистологических срезов фиксированная ткань нуждается в дополнительном уплотнении. Для этого существует несколько методов: замораживание ткани, пропитывание ее целлоидином, парафином и т. п.

После фиксации и уплотнения ткани тем или иным способом приготовляют срезы. Для получения тонких

Срезов одинаковой толщины, годных для макроскопического исследования, пользуются особыми аппаратами микротомами. Их существует несколько типов. Наиболее употребительными являются замораживающие и санные микротомы (рис. 137). Принцип устройства их состоит в том, что после каждого среза столик, к которому прикреплена исследуемая ткань, поднимается на заданную высоту. Таким образом, срезы получаются одинаковой толщины. Срез должен быть достаточно тонким и прозрачным, обычно изготовляют срезы толщиной от 4 до 15 м>км. Замораживание ткани. При изготовлении гистологических препаратов ткань замораживают на замораживающем микротоме, применяя жидкую углекислоту, эфир, хлорэтилен, или с помощью электрического тока на столике из полупроводников.

Путем замораживания ткани удается довольно быстро изготовить гистологические препараты. Этот метод используется также при исследовании тканей на отложение в них жира и жиросодержащих веществ, поскольку жиры растворяются в спиртах, ксилоле и ацетоне.

Заливка ткани в целлоидин. Для заливки препаратов в целлоидин вырезают кусочки ткани толщиной 1—3 мм и последовательно проводят через спирты возрастающей крепости — 50, 75, 95 и 100°, выдерживая по 24 ч в каждом. Через спирт крепостью 100° кусочки ткани рекомендуется проводить дважды, выдерживая по 24 ч каждый раз. Затем кусочки ткани переносят в смесь равных частей абсолютного (100°) спирта и эфира также на 24 ч. После этого кусочки ткани помещают вначале в 2%-ный, а потом 8%-ный раствор целлоидина на 2—3 дня в каждый.

Целлоидин готовят из кино — или фотопленки. Вначале ее отмывают от желатины в горячей воде, затем просушивают, мелко нарезают и растворяют в смеси из равных частей спирта и эфира. 2%-ный раствор целлоидина по консистенции сходен с жидким коллодием, а 8%-ный напоминает густой сироп. После выдержки в густом целлоидине кусочки ткани заливают этим же целлоидином в чашечке под колпаком, где он уплотняется в течение 12—24 ч. Когда целлоидин приобретет плотность эластичной резины, вырезают блоки и наклеивают их целлоидином на квадратные деревянные кубики. Можно заливать кусочки ткани целлоидином непосредственно на кубиках. Влоки необходимо маркировать, для чего на одной из боковых поверхностей кубика делают тушью соответствующее обозначение. Обычно пишут номер исследования.

Хранят кусочки, залитые в целлоидин, в 70° спирте. Заливка ткани в парафин. Обезвоживание ткани производят в спиртах восходящей крепости в том же порядке, как и при; целлоидиновой проводке. После выдержки кусочков исследуемой ткани в 100° спирте их переносят в смесь равных частей абсолютного спирта и ксилола на 2—3 ч. Затем кусочки ткани заливают чистым ксилолом и выдерживают в течение 2 — 3 ч. По истечении указанного срока их переносят в новый чистый ксилол на 2—3 ч, потом в парафин-ксилол (насыщенный раствор парафина в ксилоле при 30° С) на 1 —1,5 ч. После этого кусочки ткани помещают в чистый; парафин при температуре 54— 56° С на 1,5—2 ч. Затем их заливают парафином в бумажные или металлические формочки и охлаждают в воде. Уплотненные кусочки ткани, так же как и целлоидиновые блоки, наклеивают на деревянные кубики и маркируют.

ОКРАШИВАНИЕ СРЕЗОВ

Общие сведения. Окраска гистологических срезов основана на неодинаковом сродстве тканевых элементов к определенным красителям. Ядра клеток более способны окрашиваться основными, а цитоплазма — кислыми красками. Соответственно этому различают основные, или ядерные, и кислые, или диффузные, краски.

Наиболее часто в обычной ветеринарной патологоанатомической практике применяются окраски срезов гематоксилин-эозином по Ван-Гизону, Перлсу, Суданом III и др.

Окраска гематоксилин-эозином. Окрашивают срезы в маленьких чашках Петри или на стеклах. Этот метод применяется для окраски срезов, приготовленных любым способом. При этом ядра клеток приобретают фиолетово-синий или густо-синий цвет, а цитоплазма и волокнистое вещество — светло-синий или розово-красный. Жиры и липоиды не окрашиваются. Эритроциты млекопитающих, поскольку они ядер не содержат, окрашиваются только эозином.

Окраску срезов в чашках Петри производят следующим образом.

1. Срез переносят препаровальной иглой из воды в раствор гематоксилина на 2—5 мин.

2. Промывают в воде 2—5 мин.

3. Погружают на 10—20 с в 1%-ный раствор соляной кислоты на 70° спирте (если срез сильно перекрашен гематоксилином, его следует держать в этом растворе несколько дольше).

4. Промывают в чистой воде 5—10 мин.

5. Промывают в слабощелочном растворе (в баночку с водой прибавляют 1—2 капли нашатырного спирта) 10 мин.

6. Промывают снова чистой водой в течение 10— 15 мин. Если срез после щелочной воды недостаточно промыт, он плохо опрашивается эозином.

7. Окрашивают эозином в течение 3—5 мин.

8. Промывают в течение 1—2 мин водой. 280

9. Обезвоживают в спиртах восходящей крепости— 75, 90, 100°. Если срез перекрашен эозином, его следует несколько дольше держать в 75° спирте.

10. Просветляют в карболксилоле.

11. При помощи шпателя и иголки срез переносят на предметное стекло.

12. Высушивают фильтровальной бумагой.

13. На срез наносят каплю канадского или пихтового бальзама и накрывают покровным стеклом.

Окраска по Ван-Гизону. В срезах, окрашенных по Ван-Гизону, соединительная ткань красится в ярко-красный, остальные ткани — в желтый или серовато-желтый цвет. Ядра окрашиваются в черный или тёмно-фиолетовый цвет.

Окраску производят следующим образом.

1. Срезы интенсивно окрашивают гематоксилином (лучше гематоксилин Вейгерта) и споласкивают в воде.

2. Сразу переносят в пикрофуксин на 3—5 мин (смесь насыщенного водного раствора пикриновой кислоты—150,0 и насыщенного водного раствора кислого фуксина — 3,0—5,0).

3. Быстро промывают в воде (вода извлекает из среза фуксин).

4. Обезвоживают 95° спиртом 1—2 мин.

5. Просветляют в карболксилоле и заключают в пихтовый бальзам, как при окраске гематоксилин-эозином.

Окраска Суданом III. Судан III — нейтральная азокраска, растворимая в спирте, ацетоне и жирах, не растворимая в воде. Окраску Суданом III производят для определения в срезах жиров и липидов. Техника окраски следующая.

1. Замороженные срезы переносят изводы на 0,5— 1 мин в 50° спирт.

2. Срезы помещают в свежефильтрованный раствор Судана на 10—20 мин.

3. Споласкивают 50° спиртом в течение 0,5—1 мин.

4. Тщательно промывают водой в течение 10 — 15 мин.

5. Срезы подкрашивают квасцовым гематоксилином Эрлиха или Бемера.

6. Промывают водой в течение 3—5 мин. Перекрашенные в гематоксилине срезы дифференцируют

В 1%-ном водном растворе соляной кислоты, споласкивают подщелоченной водой, затем чистой водой.

7. Заключают в глицерин или глицерин-желатину.

8. Накрывают покровным стеклом. Окраска по Перлсу. Этот способ окраски применяют для выявления в тканях гемосидерина.

1. Из дистиллированной воды срезы переносят стеклянными иглами на 15—20 мин в свежеприготовленную смесь, состоящую из одной части 2%-ного раствора желтой кровяной соли и полутора частей 1%-ного водного раствора соляной кислоты.

2. Промывают дистиллированной водой в течение 5—10 мин.

3. Докрашивают квасцовым кармином 15—20 мин.

4. Ополаскивают в воде и проводят через спирты, карболксилол и бальзам.

Железосодержащий пигмент — гемосидерин — приобретает синевато-зеленоватый или голубоватый цвет.

Окраска по Туревичу. По способу Туревича окрашивают срезы, изготовленные из мозга, для диагностики бешенства. При этом тельца Бабеша — Негри и эритроциты окрашиваются фуксином в красный цвет, нервные клетки гематоксилином — в синий.

Для гистологического исследования берут кусочки аммонова рога и мозжечка, фиксируют их в 10%-ном формалине, ацетоне или жидкости Адуцкевича следующего состава: 80%-ной уксусной кислоты — 1 часть, хлороформа —2 части, 96° этилового спирта — б частей.

Продолжительность фиксации при комнатной температуре в формалине 1 сут, в ацетоне и жидкости Адуцкевича — 3—6 ч. После фиксации вырезают кусочки толщиной не более 1 —1,5 мм, заливают в парафин, после чего готовят гистологические срезы, высушивают и окрашивают.

Окраску по Туревичу производят следующим образом.

1. Срезы перед окраской депарафинируют в ксилоле 10—20 мин.

2. Смывают спиртом.

3. Окрашивают ядра клеток гематоксилином Вей-герта в течение 2 мин.

4. Срезы промывают водой.

5. Дополнительно окрашивают 1 % — ным раствором

Кислого фуксина в течение 1 мин.

6. Промывают водой.

7. Дифференцируют в смеси 95° спирта и насыщенного водного раствора пикриновой кислоты в течение 10—20 с до ясно-желтого оттенка.

8. Высушивают фильтровальной бумагой.

9. Обезвоживают абсолютным спиртом.

10. Просветляют в ксилоле в течение 1 мин.

11. Заключают в канадский, или пихтовый, бальзам.

Рис. 137. Общий вид замораживающего микротома:

/ — шланг для подачи углекислоты;

2—- столик; 3 — нож.

Метки: