Трансплантація ембріонів — новий біотехнологічний метод прискореного відтворення високопродуктивних тварин, який є одним із способів інтенсивного використання генетичного потенціалу самок.
Під трансплантацією ембріонів розуміють вилучення ембріонів із статевих органів однієї самки і пересадку їх в статеві органи іншої самки. Вона проводиться у більшості лабораторних тварин, приматів і сільськогосподарських тварин. Найбільш поширений цей метод у скотарстві.
Трансплантація ембріонів ефективна лише при використанні генетично цінних високопродуктивних тварин, які перевірені за якістю нащадків і визнані поліпшувачами.
Використовуючи 20 корів-рекордисток в якості донорів для отримання від них ембріонів, протягом 2-3 років можна створити високопродуктивне молочне стадо в 200-300 корів.
Традиційним способом від такої кількості тварин за 2-3 роки можна отримати не більше як 30 телиць і 30 бичків.
Таким чином, перевагою трансплантації ембріонів є можливість прискорити селекційний процес за рахунок одержання від племінних самок в 20 разів більше потомства, ніж при фізіологічній репродукції. Саме тому є можливість досить швидко формувати ремонтні групи самок з видатними показниками, поліпшувати адаптацію народжених від реципієнтів в різних географічних зонах, зберегти генофонд локальних, вимираючих і аборигенних видів тварин.
Трансплантація ембріонів — єдиний метод отримання потомства від цінних у племінному відношенні самок, які не можуть виношувати плід внаслідок патології матки.
При пересадці ембріонів не існує тканинної несумісності, що зумовлено імунологічною толерантністю порожнин яйцепроводів і матки як донорів, так і реципієнтів. Окрім цього, до початку імплантації (нідації) ембріонів (безпосереднього контакту прохоріона ембріона та слизової оболонки матки) проходить тривалий час (7-16 днів залежно від виду тварин), протягом якого відбувається пристосування ембріона до нового, материнського організму.
В основі технологічних вирішень трансплантації лежать загальнобіологічні відомості щодо нервово-гуморальної регуляції статевої функції, запліднення, внутрішньоутробного розвитку зиготи та ембріона, а також потенціалу фолікулів на різних стадіях зрілості.
7.1.1. Технологія трансплантації ембріонів
Трансплантацію ембріонів проводять хірургічним або нехірургічним методами.
Хірургічний метод характеризується тим, що у донора вимивають ембріони з рогів мати після лапаротомії. Цей метод одержання ембріонів у донора закінчується хірургічним введенням ембріонів реципієнту.
Нехірургічний метод полягає в тому, що ембріони у донорів вимиваються з рогів матки при допомозі спеціальних інструментів, які вводяться в статеві шляхи самки через трохи відкриту шийку матки. Вводяться ембріони таким же чином, ближче до верхівок рогів матки.
Хірургічний метод трансплантації ембріонів може використовуватися на лабораторних і сільськогосподарських тваринах, а нехірургічний — лише у великих тварин, де є можливість мануально, трансректально контролювати положення інструментів у статевих органах самок.
Незалежно від методу трансплантації ембріонів, технологія включає:
Відбір донорів і реципієнтів;
Синхронізацію статевої охоти у донорів і реципієнтів;
Провокування суперовуляції у донорів;
Осіменіння донорів;
Вимивання ембріонів;
Пошук та оцінка ембріонів;
Пересадку і зберігання ембріонів;
Лізис жовтого тіла у донорів;
Контроль результатів трансплантації.
Донорами вважають тих самок, у яких отримують ембріони. Відбір тварин у донорську групу проводять за комплексом спеціальних ознак (стандарт породи, родовід, продуктивність) і повноцінність статевої функції.
Реципієнтами вважають тих самок, яким пересаджують або підсаджують ембріони. Їх відбирають із фізіологічно зрілих тварин. Доцільно підбирати реципієнтів серед малопродуктивних, аборигенних самок. Чим більша різниця в продуктивності донора і реципієнта, тим більший економічний ефект трансплантації.
Донорів і реципієнтів відбирають в благополучних за інфекційними та інвазійними хворобами господарствах після діагностичних досліджень і карантину.
Синхронізація статевої охоти у донорів і реципієнтів — приведення організму цих тварин до однакового нервово-гуморального стану відносно статевого циклу. Вона буває природною і штучною.
Природною синхронізація буває в тому випадку, коли статева охота і осіменіння у донора збігається із спонтанною охотою у реципієнта. Штучна синхронізація досягається введенням препаратів простагландину, F2α (естрофан, прозольвін, клатрапростин, суперфан і ін.), які здатні викликати лізис жовтого тіла яєчників, що зумовлює ріст, розвиток, дозрівання везикулярних фолікулів, прояв феноменів стадії збудження статевого циклу, або ж — коїтальним провокуванням овуляції у кролиць і кішок.
Синхронізованим статевий цикл вважається тоді, коли у донора і реципієнта співпадає день прояву статевої охоти. Допускається відхилення не більше як ±1 доба. Кращі результати отримують при абсолютному збіганні в часі прояву охоти у донора і реципієнта.
Спрямований вплив на фізіологічну періодичність функції яєчників з допомогою гонадотропних гормонів дозволяє стимулювати фолікулогенез — прискорювати дозрівання ооцитів до яйцеклітин і викликати численну овуляцію фолікулів (суперовуляцію).
Для суперовуляції використовують гонадотропні гормони з високим вмістом фолікулостимулюючого гормону (ФСГ, СЖК, графолон, фолікотропін, фолігон, інтергонан і ін.). В даний час високо очищені препарати ФСГ отримують із гіпофіза трьох видів сільськогосподарських тварин – коней, овець і свиней. Препарати ФСГ мають у своєму складі незначну кількість лютеїнізуючого гормону (ЛГ). ФСГ і ЛГ підсилюють один одного, що називається ефектом ауглентації. Головна дія ФСГ полягає в стимуляції численного росту фолікулів, що супроводжується проліферацією клітин гранульози. Але фолікули під дією одного ФСГ не досягають повного розвитку, не дозрівають до граафових міхурців, які продукують естрогени. В той же час ФСГ готує структури яєчників до біосинтезу статевих гормонів, стимулює активність ароматизувальних ферментів, які виконують останній етап біосинтезу естрогенів – утворення їх з андрогенів. При взаємодії ФСГ з ЛГ відбувається стимуляція розвитку інтерстиціальної тканини яєчників, розвиток фолікулів до граафових міхурців і секреція ними естрогенів, що зумовлює повноцінний прояв феноменів стадії збудження, котра закінчується суперовуляцією.
Осіменіння донорів проводиться штучно або природно. При штучному осіменінні дозу сперми збільшують в кілька разів. Воно проводиться до припинення статевої охоти.
Вимивання ембріонів проводять як хірургічним, так і нехірургічним методами. При використанні хірургічного методу у тварин реєструються післяопераційні ускладнення — спайки, що не дає можливості використовувати донорів більше трьох разів. Тому в практиці трансплантації частіше застосовують нехірургічний метод вимивання ембріонів. Головною перевагою нехірургічного отримання ембріонів є відсутність ризику порушення відтворної здатності у тварин.
Пошук ембріонів проводиться візуально при допомозі бінокулярної лупи при 15-20-кратному збільшенні. Після нехірургічного вимивання промивальну рідину збирають в ембріоприймачі — скляні циліндри або флакони, які витримують у термостаті 20 хвилин при +37 °С. Протягом цього часу ембріони осідають на дно. Потім верхню частину рідини відкачують при допомозі стерильного сифона та шприца з довгою голкою, залишаючи 60-100 мл. Залишок переносять у 2-3 чашки Петрі, дно яких розкреслене на квадрати 1´1 см. Пошук проводять по квадратах справа наліво, зверху вниз і навпаки.
Якщо в промивальній рідині багато слизу, то її розбавляють розчином для вимивання ембріонів і досліджують слиз, маніпулюючи голкою; при великій кількості крові додають промивальний розчин і центрифугують протягом 3-5 хвилин при 3-5 тис. обертів/хв. В цьому випадку осад гомогенізується. Після дослідження рідини на наявність ембріонів чашки Петрі кілька разів коливають, щоб виявити ембріони, які прилипли до стінок.
Виявлені ембріони піпеткою Пастера переносять на годинникові скельця з поживним середовищем для тимчасового зберігання (промивальна рідина + 20 % фетальної сироватки крові теляти або сироватки крові вівці чи оленя) і зберігають в термостаті при +37 °С у чашках Петрі, дно яких вкрите зволоженим фільтрувальним папером. При хірургічному методі трансплантації промивальну рідину зразу ж збирають у чашки Петрі.
Якість ембріонів визначають методами: візуальної морфологічної оцінки, фарбуванням з використанням люмінісцентних фарбників, культивуванням за межами організму протягом 24-48 год.
Морфологічну якість ембріонів визначають під мікроскопом при 100-160-кратному збільшенні. Встановлюють стадії їхнього розвитку (ранні та пізні морули і бластоцисти), а також оцінюють якість (відмінну, добру, задовільну). Розрізняють умовно придатні та непридатні до трансплантації ембріони. В промивальній рідині можуть виявитися і яйцеклітини, що свідчить про відсутність запліднення.
Морула — це скупчення бластомерів, які не завжди однакові за розмірами через асинхронність дроблення. Цитоплазма бластоцитів гомогенна, вони мають полігональний зв’язок. Перевітеліновий простір вільний від гранул і включень Товщина прозорої оболонки 15 мк.
У ранньої бластоцисти (6,5-7 діб) добре видно бластопорожнину, реєструється диференціювання клітин на трофобластичні та ембріобластичні. Перевітеліновий простір вузький, а прозора оболонка має товщину 15 мк.
Пізня бластоциста (8 діб) відрізняється від ранньої тим, що вона має суцільні клітини трофобласта і велику порожнину, яка займає майже всю площу перивітелінового простору. Прозора оболонка витончена і розтягнута. З 9-го дня у бластоцист прозора оболонка відсутня і добре виражена порожнина.
Ембріони з частковою дегенерацією характеризуються несиметричним розміщенням і різними розмірами бластомерів. У бластомерів може виявитися частковий розпад, порушення зв’язку, відсутність ділення у двох або трьох.
У бластоцист часто реєструється збільшення об’єму перевітелінового простору, стискування бластопорожнини, частковий розпад клітин трофобласта. Прозора оболонка має невеликі тріщини. Такі ембріони умовно придатні до трансплантації.
Дегенеровані ембріони на 3-4 ділення дроблення відстають від нормального розвитку. Вони характеризуються розпадом бластомерів, зміщенням і фрагментацією цитоплазми, яка виявляється у перевітеліновому просторі. Прозора оболонка має значні дефекти: тріщини, розшарування, розриви. Такі ембріони вибраковують.
Незапліднені яйцеклітини мають форму сфери, прозорий перевітеліновий простір; гомогенне розміщення цитоплазматичних тілець. Шкала оцінки якості морул і бластоцист представлена в таблиці 7.1.
Таблиця 7.1 – Шкала оцінки якості морул і бластоцист
| Стадія
Розвитку |
Морфологічна характеристика | Оцінка | Бали | Умовні позначення |
| Морула рання (Мо I),
Морула пізня (Мо II) |
Округла форма, прозора оболонка ціла, перевітеліновий простір прозорий, бластомери чіткі, однакових розмірів з полігональним зв’язком, цитоплазма має дрібнозернистий вигляд, рівномірно заповнює цитоплазматичну оболонку.
В перевітеліновому просторі є гранули, включення, бластомери неоднакових розмірів, розміщені не симетрично, дещо стиснуті. В перевітеліновому просторі — гранули, включення, незначне стискання бластомерів, руйнування окремих бластомерів, “частковий зародок.” Деформація прозорої оболонки, часткове руйнування бластомерів, порушення зв’язків між ними, фрагментація цитоплазми, стискування бластомерів. Невідповідність стадії розвитку, віку ембріона, дефекти прозорої оболонки (тріщини, відколки), розпад бластомерів, сильне їхнє стискування. |
Відмінно
Добре Задовільно Умовно придатна Непридатні |
5
4 3 2 1 |
++
+ + – + – – – – |
Продовження табл. 7.1
| Бластоциста рання (Бл I),
Пізня (Бл II) |
Округла форма, прозора оболонка має однакову товщину на всьому протязі, перевітеліновий простір вузький, прозорий, чітко диференційовані клітини трофобласту і ембріобласту, з добре вираженою бластопорожниною. Зона пелюцида сплющена, перевітеліновий простір відсутній, порожнина бластоциста велика, має гладеньку поверхню, чітку диференціацію клітин.
Порожнина бластоцисти не виражена, в перевітеліновому просторі – гранули, включення, клітини трофобласту дещо стиснуті. Перевітеліновий простір – збільшений, має включення, гранули; бластопорожнина не виражена, немає диференціації між клітинами трофобласту і ембріобласту. Дефект прозорої оболонки (тріщини), гранули, клітинні ферменти в перевітеліновому просторі, часткове руйнування клітин, стиснуті бластомери. Значний дефект прозорої оболонки, руйнування бластомерів. |
Відмінно
Добре Задовільно Умовно придатні Непридатні |
5
4 3 2 1 |
++
+ – + – + – – – – |
Оцінка ембріонів з використанням люмінісцентних фарбників грунтується на різному ступені проникнення фарбників через прозору оболонку живих і мертвих ембріонів. Ембріони з рідиною розміщують на предметному склі і додають фарбник. Інкубацію проводять протягом 10 хвилин в темряві, при кімнатній температурі. Після інкубації фарбник змивають розчином Локка і накривають покривним склом. Оцінку життєздатності проводять під люмінісцентним мікроскопом протягом 1,5 хвилин. Живі ембріони набувають червонуватого відтінку, а мертві — зеленуватого.
Оцінка ембріонів методом культивування у поживних середовищах базується на здатності повноцінних ембріонів в оптимальних умовах продовжувати розвиток. Вона також дозволяє зберегти їхню життєздатність до пересаджування протягом 24-48 годин і дає можливість додатково визначати непридатність ембріонів до трансплантації. Для культивування ембріонів використовують поживні середовища: ТС-199, Хема, Г-10, Ігла, сольові розчини Дюльбекко, Брінстера з різними біологічними і синтетичними добавками. Осмотичний тиск поживних середовищ повинен бути близько 300 міліосмолей, а рН–7,2-7,4. Частіше використовують сольовий розчин Дюльбекко з 20-30 %-ною сироваткою крові і пеніцілліна — 100 од/мл.
Культивування ембріонів проводять на годинникових скельцях в 0,2 мл поживного середовища під шаром стерильного вазелінового масла (25 крапель). Годинникові скельця поміщають у чашки Петрі і кладуть в ексікатор, який ставлять в термостат (t +37 °С). Підтримання оптимальних умов для розвитку ембріона досягається пропусканням через ексікатор зволоженої газової суміші (90 % азоту, 5 % кисню, 5 % діоксиду вуглецю).
Існують більш прості методи культивування ембріонів — в пробірках і соломинках. При цьому ембріони піпеткою Пастера переносять в пробірку 50´5 мл в 1,0 мл поживного середовища, добавляють 3-5 крапель вазелінового масла, закривають алюмінієвою фольгою і переносять у термостат (+37 °С). В соломинку ембріони переносять при допомозі 1 мл шприца з гумовим перехідником. Спочатку набирають 0,03 мл середовища, 0,01 мл повітря і 0,02 мл середовища. Кінці соломинки закривають і ставлять в термостат (+37 °С) на час інкубації.
Ембріони можна культивувати протягом 95 годин.
Розроблено метод довготривалого зберігання ембріонів із застосуванням глибокого заморожування у рідкому азоті при температурі 196 °С (кріоконсервування). Перевагою цього методу є:
— тривале зберігання ембріонів;
— можливість їхнього транспортування;
— використання ембріонів при наявності реципієнта.
Для заморожування беруть лише свіжоотримані ембріони відмінної та доброї якості.
Заморожування ембріонів проводиться за допомогою автоматичних приладів, які складаються з трьох частин: електронного блоку, камери для заморожування та посудини з рідким азотом. Як холодоагент використовуються пари рідкого азоту.
Головною метою кріоконсервування є повне гальмування за допомогою холоду обміну речовин і розвитку ембріона.
Підготовка ембріонів до заморожування складається з постійного їх переносу до розчинів кріопротекторів із наростаючою концентрацією. Для захисту ембріонів готують фосфатно-сольовий буфер (ФБС), до складу якого входять 100 000 од/л пеніциліну і 20 % сироватки крові. Консервація кріопротектора — гліцерину складає від 1,0 М до 1,4 М. Починають насичувати ембріони з меншої концентрації, а готують кріопротектор, починаючи з більших концентрацій.
Кріозахисні властивості гліцерину зумовлені його фізико-хімічними властивостями, характером взаємодії з молекулами води, неорганічними та органічними компонентами середовища. Гліцерин легко проникає до клітин, в яких утворюються стабільні водневі зв’язки з водою, завдяки чому зменшується кількість кристалізованої вільної води. Він сприяє переходу до твердої фази без утворення кристалів у так званий аморфний, скловидний стан. Крім того, гліцерин не кристалізується одночасно з водою, завдяки чому знижується концентрація електроцитів. Він сповільнює точку замерзання води в клітині та процес кристалізації, обумовлює дрібнокришталеве замерзання розчинів, знижує інтенсивність осмотичних і дифузних процесів в клітинах, утворює водневі зв’язки з гідрофільними ділянками білків і захисну оболонку навколо білкової молекули, тримає Н-групи сусідніх білків на відстані, достатній для запобігання реакції між ними.
Насичення ембріонів кріопротектором проводять в кілька етапів. Спочатку ембріон стискується внаслідок втрати води доти, поки виділення води не збалансується з надходженням кріопротектору. Врівноваження закінчується тоді, коли вода, що надходить до клітин, збільшує її об’єм до ізотонічного розчину.
Насичення ембріонів гліцерином проводять при кімнатній температурі в межах чашки Петрі або на годинниковому склі, куди переносять ембріони, що мають повну концентрацію. Ембріони відмінної якості можна насичувати одноетапно, без попередньої проводки в розчинах 1,0 М або 1,4 М гліцерину протягом 30 хвилин.
Підготовлені до заморожування ембріони переносять, як правило, в пластикові соломинки, об’ємом 0,25 мл або в скляні пробірки 50´6 мл чи ампули місткістю 1мл.
В кожну пробірку чи ампулу поміщають 1-4 ембріони одного донора в 0,3-0,4 мл розчину кріопротектора. В соломинках заморожують 1-2 ембріони. Заправку компонентів в соломинку проводять в такій послідовності: розчин гліцерину (2/5 об’єму), міхурець повітря, ембріони в 1,4 М розчині гліцерину (2/5 об’єму соломинки). Стовпчик розчину кріопротектора повинен торкатись пижа в соломинці.
Пробірки з ембріонами закривають фольгою, скляні ампули запаюють, а соломинки закривають спеціальними пластиковими пробками. Посудини маркірують і дані заносять у журнал. Далі їх переносять у відповідне гніздо холодильної камери й охолоджують у режимі: від +20 до –6 °С зі швидкістю 1 °С/хв; від -6 до -35 °С зі швидкістю 0,3 °С/хв. Після цього посудини переносять у рідкий азот. Ембріони зберігають в посудинах Дюара різного об’єму, в спеціальних каністрах із оргскла, фторопласту. Транспортують ембріони в посудинах Дюара.
Відтаювання ембріонів і підготовка їх до пересадки Або підсадки. Відтаювання ембріонів проводять на водяній бані при температурі +25 °С або +37 °С. Посудину з ембріонами витягують з посудини Дюара і опускають у водяну баню на 10-12 секунд до повного зникнення льоду. Протягом відтаювання посудину поступово переміщують у воді маятникоподібними рухами.
Ембріони, які відтаяли, в краплі розчину переносять на годинникове скло і проводять попередню морфологічну оцінку їх якості, а потім відмивають ембріони від кріопротектора в послідовності, від більшої концентрації до меншої. Після цього ембріони тричі промивають в свіжих порціях середовища ФБС + 20 % сироватки крові, а потім їх переносять в це ж середовище на 10-20 хвилин.
Після вимивання проводять остаточну морфологічну оцінку ембріонів під мікроскопом. Ембріони, що придатні до пересадки, використовуються, а сумнівної якості культивуються в термостаті при +37 °С до 2-х годин, з подальшою їхньою морфологічною оцінкою.
Пересадку ембріонів виконують катетером, в який вводиться пластикова соломинка з ембріоном. Соломинки заповнюють в такій послідовності: 1 см середовища (ФБС), 1 см повітря, 1 см середовища з ембріоном, 1см повітря, 1 см середовища (ФБС). Катетер із соломинкою поміщають в чохол, встановлюють в контейнер і в горизонтальному положенні переносять до реципієнта.
Пересадка і підсадка ембріонів відрізняється тим, що в першому випадку одержані ембріони вводять синхронізованому реципієнту, який не осіменявся паралельно з донором. Якщо ж реципієнта осіменяли водночас з донором, то йому ембріони підсаджують. Незалежно від методу трансплантації (хірургічного або нехірургічного) пересадка або підсадка ембріонів проводиться ближче до верхівок рогів матки.
Лізис (розсмоктування, інволюція) жовтих тіл у донорів проводять внутрішньом’язовим введенням препаратів простагландину — F2α.
Контроль результатів трансплантації ембріонів проводять за методами визначення вагітності.