Методи оцінки якості сперми

Результативність штучного осіменіння самок залежить від якості сперми, яку отримали від плідника. Оцінка сперми дає можливість насамперед визначити її біологічну повноцінність, тобто забезпечувати запліднення й отримання здорового потомства. Оцінка включає ряд обов’язкових і додаткових методів. На племпідприємствах обов’язково проводять загальну (візуальну) оцінку еякуляту з визначенням його об’єму, кольору, запаху та консистенції і лабораторну (мікроскопічне дослідження), при якій досліджують густоту сперми, рухливість і концентрацію сперміїв у ній. Зазначені методи дозволяють швидко з’ясувати можливість використання отриманого еякуляту і визначити оптимальний ступінь розрідження. Додаткові методи, які дозволяють більш детально охарактеризувати якість еякуляту, включають визначення процента живих і мертвих сперміїв, кількості патологічних форм, виживаності сперміїв у зовнішньому середовищі, їх метаболічної активності, резистентності сперміїв до несприятливих умов та інші.

На пунктах штучного осіменіння обов’язковим є визначення рухливості сперміїв, а при необхідності – виживаності при температурі 38±0,5 °С і концентрації сперміїв.

Візуальна оцінка еякуляту. Вимірювання Об’єму Необхідне для визначення необхідного ступеня наступного розрідження сперми, а також для оцінки якості спермопродукції плідника. Для його визначення використовують градуйовані спермоприймачі, пробірки, піпетки, а для жеребця і кнура – мензурки. При застосуванні одноразових поліетиленових спермоприймачів об’єм еякуляту можна визначити методом зважування (з розрахунку, що 1 мл сперми відповідає 1 г).

Нормальний об’єм еякуляту в барана становить 1–2 мл (максимальний – 3,5 мл), у бугая – 4–5 мл (15 мл), у жеребця 50–100 (600 мл), у кнура – 200–400 мл (1000 мл). Зменшення об’єму еякуляту відносно нормативних показників називається Олігосперматизмом.

Визначення Кольору Сперми проводять у проникаючих променях світла при достатньому освітленні. У бугая і барана сперма має білий колір із жовтуватим відтінком, у кнура і жеребця – молочно-білий із сіруватим відтінком.

Наявність в еякуляті крові, гною, сечі зумовлює появу відповідно червоного, зеленого і жовтого відтінків. При запаленні міхурцеподібної залози у спермі з’являються білі пластівці.

Запах сперми Свідчить про якість санітарно-гігієнічної підготовки самця перед отриманням сперми, а також про наявність домішок в еякуляті при деяких інфекційних хворобах. У нормі сперма не має запаху. У спермі барана допускається запах жиропоту; запах парного молока – у спермі бугая.

Консистенція сперми. У нормі сперма бугая має вершкоподібну консистенцію, у барана – сметаноподібну, у кнура і жеребця – водянисту. Еякулят жеребця може містити домішки слизу секрету міхурцеподібної залози, а сперма кнура – глейкого секрету куперових залоз у вигляді дрібних зерен. Змінюється консистенція при зменшенні кількості сперміїв та запаленні геніталій.

Оцінка сперми за густотою та рухливістю сперміїв є однією з найважливіших і доступних для виробництва. Густоту і рухливість сперміїв визначають за допомогою моно — або бінокулярного мікроскопа з об’єктивами ´8, 20 (40) і 90, окулярами ´7, 10, 15 та освітлювачів.

Для правильної оцінки сперми мікроскоп поміщають у спеціальний термостат із температурою 38–40 °С або використовують обігріваючі столики. Оцінку проводять методом роздавленої краплі. Для цього на чисте підігріте предметне скло наносять краплю сперми і накривають її покривним склом, після чого досліджують під мікроскопом.

Залежно від концентрації сперміїв, сперма жуйних за густотою може бути густа (Г), середня (С) та рідка (Р).

Густою є сперма, якщо в полі зору між сперміями майже немає проміжків, середньою – коли проміжки між сперміями добре виражені, а рідка сперма характеризується проміжками, що перевищують довжину спермія.

Таблиця 5.2.1 – Залежність густоти сперми від концентрації сперміїв

Плідник Густота сперми, млрд/мл
Густа Середня Рідка
Бугай

Баран

Кнур

Жеребець

>1,0

>2,0

0,20

0,25

0,5–1,0

1,0–2,0

0,10–0,20

0,15–0,25

<0,5

<1,0

<0,10

<0,15

 

При олігоспермії в 1 мл сперми у бугая міститься менше 0,5 млрд. спермальних клітин, у барана – менше 1 млрд., у кнура і жеребця – менше 0,1 і 0,15 млрд. відповідно. Відсутність сперміїв в еякуляті називається Аспермією.

До використання допускають сперму баранів лише густу, а бугаїв, кнурів і жеребців – густу і середню.

Методика визначення рухливості сперміїв. Рухливість сперми визначають одночасно з густотою. За характером руху сперміїв у спермі їх можна розділити на чотири групи: спермії з прямолінійно-поступальним (лінійне переміщення в напрямку власної поздовжньої осі), спермії з манежним (рух по колу) і коливним (рух лише хвостової частини спермія без переміщення самої клітини) та зовсім нерухомі спермії. Запліднювальна здатність сперми залежить від співвідношення між кількістю сперміїв першої і другої – четвертої груп. Тому рухливість сперми визначають як процент сперміїв, які рухаються прямолінійно-поступально до загальної кількості сперміїв (оцінюють за десятибальною шкалою). Кожний бал дорівнює 10 % сперміїв, які рухаються прямолінійно-поступально. Таким чином, якщо 100 % сперміїв мають прямолінійно-поступальний рух, то сперму оцінюють у 10 балів, при 90 % – у 9, при 80 % – у 8 і т. д.

Визначення концентрації сперми. Концентрація сперми – це кількість статевих клітин в 1 мл сперми. Визначають її такими методами: підрахунку сперміїв у лічильній камері (гемоцитометрі); за допомогою фотоелектроколориметра, спектрофотометра або іншого подібного приладу; порівняння каламутності розбавленої сперми зі спеціально відкаліброваними стандартами; визначення об’єму або ваги сперміїв у пробірці після центрифугування та ін.

Найбільш простим і доступним методом є безпосередній підрахунок сперміїв у гемоцитометрі із сіткою Горяєва. Для цього попередньо сперму барана і бугая набирають в еритроцитарний меланжер відповідно до мітки 0,5 і 1 (розбавлення сперми бугая в 100 раз, сперми барана – в 200 раз), а сперму жеребця і кнура – у лейкоцитарний до мітки 0,5 (розбавлення в 10 і 20 раз відповідно). Потім у змішувач набирають 3 %-ний розчин натрію хлориду – до поділок 101 або 11 відповідно. Великим і вказівним пальцями затискують кінці меланжера і струшують протягом 2–3 хв. Перед внесенням сперми в лічильну камеру з капіляра змішувача видаляють чотири краплі, а після цього добре притирають покривне скло до пластинки камери і наносять збоку на сітку невелику краплю сперми з меланжера.

Підраховують кількість сперміїв при збільшенні мікроскопа в 200–400 разів у п’яти великих (80 малих) квадратах по діагоналі. Рахують лише головки сперміїв, які розміщені всередині малих квадратів та на їхніх лівих і верхніх лініях.

Концентрацію сперміїв вираховують за формулою:

Де: С – концентрація сперміїв (млрд) у 1 мл сперми; H – кількість сперміїв, підрахованих у 80 малих квадратах; D – ступінь розрідження

Числа у формулі є постійними величинами: 4000 – це число переведення на кубічний міліметр (мм3); 1000 – число переведення на мл; 80 – кількість малих квадратів.

Наприклад: При визначенні концентрації сперміїв у бугая у 80 малих квадратах підраховано 300 сперміїв:

Знаючи концентрацію сперміїв, їх рухливість і об’єм дози, можна визначити кількість сперміїв у дозі з ППР. Для цього вираховують концентрацію сперміїв у дозі.

Наприклад: Сперма бугая зберігалась в облицьованих гранулах об’ємом 0,33 мл в дозі. Концентрація сперміїв в 1 мл – 1,5 млрд. Рухливість сперміїв – 4 бали (40 %).

Кількість сперміїв у дозі становить:

Кількість сперміїв у дозі з ППР становитиме:

Тобто таку сперму можна використовувати для осіменіння корів.

Визначення процента живих і мертвих сперміїв. Для такої оцінки використовують 5 %-ний розчин еозину, який забарвлює лише мертві спермії та спермії з коливальним рухом. Для забарвлення мертвих сперміїв у спермі жеребця застосовують фарбу конго-рот (на 100 мл 7 %-ного розчину глюкози – 1 г фарби).

Досліджують сперму з концентрацією сперміїв 0,2–0,4 млрд/мл, при більшій концентрації еякулят розріджують 3 %-ним розчином цитрату натрію.

Для визначення проценту живих і мертвих сперміїв на край знежиреного предметного скла піпеткою або скляною паличкою наносять невелику краплю сперми та 2–3 краплі розчину еозину, який готують на 3 %-ному розчині цитрату натрію. Краплі швидко перемішують і з суміші роблять тонкий мазок на предметному склі, який швидко підсушують. Дослідження проводять під мікроскопом при збільшенні в 600–900 разів.

У декількох полях зору підраховують підряд 500 сперміїв. Окремо ведуть облік тих, що були на час забарвлення живими і мертвими. Живими були ті, що не мають забарвлення цитоплазми головки, а мертвими – із забарвленням. Процент мертвих сперміїв визначають за формулою:

Де: П – процент мертвих сперміїв; М – кількість підрахованих мертвих сперміїв; 100 – стала для переведення в проценти; 500 – кількість сперміїв, які підрахували.

Якщо всі спермії мертві, то таке явище називають Некроспермією.

Визначення вмісту патологічних форм сперміїв. СПермії Кожного виду тварин мають свою характерну форму і розміри. Наявність в еякуляті значної кількості клітин патологічних форм (сперміїв гігантських і карликових розмірів, з деформованими головками і хвостами, із двома головками і хвостами тощо) знижує заплідненість самок. Тому на племпідприємствах необхідно періодично (один-два рази на рік) визначати вміст сперміїв із патологічними формами і при збільшенні їх кількості проводити андрологічне дослідження самця-плідника для виявлення причин цієї патології.

Сперму барана розбавляють 0,9 %-ним розчином натрію хлориду у 20–30 разів, бугая – у 10–15, сперму жеребця і кнура – у 2–3 рази. На предметне скло наносять краплю сперми і роблять тонкий мазок, який висушують, фіксують 96%-ним спиртом протягом 1–2 хвилин і забарвлюють 1–2 %-ним розчином фуксину, еозину або метиленового синього. Для цього на мазок кладуть смужку фільтрувального паперу і наливають на неї барвник – на 3–5 хв. Потім мазок змивають дистильованою водою і висушують.

Мікроскопію мазка проводять при збільшенні в 600–1350 разів і підраховують у кількох полях зору не менше 200 нормальних і патологічних сперміїв. Нормальні і патологічні форми сперміїв підраховують окремо.

Процент вмісту сперміїв із патологічною формою визначають за формулою:

Де: N – кількість сперміїв із патологічною формою.

Для осіменіння дозволяють використовувати сперму барана, якщо в ній міститься не більше 14 % патологічних форм, сперму бугая – не більше 18 %, кнура – не більше 20 % і жеребця – не більше 25 %. Наявність у спермі патологічних сперміїв понад допустимі норми називається Тератоспермією.

Визначення інтенсивності дихання сперміїв Базується на використанні сперміями кисню метиленового синього, який додають у сперму, внаслідок чого відбувається знебарвлення розчину. Пояснюється це тим, що в процесі гліколізу при окисненні фосфогліцеринового альдегіду виділяється водень, який перетворює піровиноградну кислоту в молочну. Метиленовий синій є вираженим акцептором водню. При приєднанні двох іонів водню цей барвник втрачає свій темно-синій колір і перетворюється в лейкометиленовий синій білого кольору. Реакція повинна проходити без доступу кисню, оскільки останній швидко окиснює лейкометиленовий синій у метиленовий.

За методикою М. П.Шергіна на предметне скло підігріте до 30–37 °С, очною піпеткою наносять краплю отриманої сперми бугая або барана і додають до неї краплю 0,01 %-ного розчину метиленового синього, підігрітого до 30 °С. Скляною трубочкою із внутрішнім діаметром 0,8–1 мм швидко змішують обидві краплі і набирають у неї суміш так, щоб утворився стовпчик довжиною 2 см без міхурців повітря. Трубку кладуть на білий папір при температурі 20 °С і спостерігають, через який час стовпчик суміші блакитного кольору знебарвиться. На кінцях трубки, де сперма контактує з повітрям, знебарвлення не проходить. Отримані результати звіряють із даними таблиці і визначають якість сперми.

Таблиця 5.2.2 – Оцінка якості сперми за часом знебарвлення метиленового синього (хв)

 

Якість сперми Бугай Баран
Добра

Середня

Низька (не дозволяється для осіменіння)

5–10

11–30

Більше 30

3–7

8–12

Більше 12

Визначення виживаності сперміїв. При штучному осіменінні сперма використовується не зразу після її отримання, а лише після певного строку зберігання. У цей період запліднювальна здатність сперміїв буде залежати від їх виживаності.

Для визначення виживаності сперміїв у заморожених спермодозах застосовують експрес-метод. Сперму розморожують у біотермостаті при температурі 38±0,5 °С. Фіксують час розморожування й одночасно визначають початкову рухливість сперміїв. Через 5 годин оцінку повторюють. Якщо рухливість сперми становитиме 0,5 бала (5 % сперміїв рухатимуться прямолінійно-поступально) і більше, то така сперма придатна для використання.

Визначення резистентності сперміїв Базується на імітації несприятливих для сперміїв умов і перевірки стійкості статевих клітин до розбавлення і збереження їх при низьких температурах.

За методикою В. І.Короткова резистентність визначається за показником стійкості сперміїв до розведення 1 %-ним розчином хлориду натрію і виражається кількістю (мілілітрів) вказаного розчину, який необхідно додати до 1 мл сперми, щоб припинити прямолінійно-поступальний рух сперміїв. У свіжоотриманій спермі резистентність визначають у перші 15 хвилин.

Для багаторазового розведення сперми 1 %-ним розчином хлориду натрію необхідно мати три пробірки. У пробірку № 1 наливають 10 мл 1 %-ного розчину хлориду натрію, потім мікропіпеткою відмірюють 0,02 мл сперми. Цим же розчином кілька разів промивають мікропіпетку. Краплю суміші досліджують під мікроскопом на рухливість. Якщо спермії нерухомі, то резистентність становить 500, оскільки, додаючи до 0,02 мл сперми 10 мл розчину хлористого натрію, її розвели в 500 разів.

Якщо в першій пробірці спермії були рухомими, то 0,5 мл суміші з цієї пробірки переносять у пробірку № 2 і додають 0,5 мл 1 %-ного розчину хлориду натрію. Після змішування краплю суміші досліджують на рухливість: якщо спермії нерухомі, резистентність становить 1000, оскільки в пробірці № 2 сперма була розбавлена у 2 рази. При наявності в краплі сперміїв із поступально-прямолінійним рухом із пробірки № 2 0,5 мл суміші переносять у пробірку № 3, додають знову 0,5 мл розчину хлориду натрію. Якщо спермії в суміші пробірки № 3 виявились нерухомими, то резистентність їх не перевищує 2000, оскільки сперму знову 2 рази розводили розчином хлориду натрію.

При наявності в краплі суміші сперміїв із поступально-прямолінійним рухом у пробірку № 3 додають 0,5 мл 1 %-ного розчину хлориду натрію і досліджують під мікроскопом. Додавання в пробірку № 3 1 %-ного розчину хлориду натрію по 0,5 мл проводять до того часу, поки в черговій краплі суміші перестануть виявлятись спермії з прямолінійно-поступальним рухом. При розрахунку резистентності сперміїв враховують те, що при кожному додаванні 0,5 мл 1 %-ного розчину хлориду натрію ступінь розбавлення сперми збільшується на 1/2; 1/3; 1/4; 1/5 і т. д., тобто на 2000.

Резистентність сперміїв бугая і барана повинна бути в межах 10–40 тис.

Метки: ,