Реакцию ставят в водяной бане в общем объёме 2,5 см3 всех компонентов при 37.—38° С.
а) гемолнзин— рабочий титр не менее 1 :1 000;
б) бруцеллёзный антиген-экстракт бруцеллёзных микробов (в титре, установленном учреждением, изготовившим его);
в) комплемент—свежая или консервированная сыворотка морской свинки;
г) испытуемая сыворотка и сыворотка нормальная и бруцеллёзная для титрации комплемента в бактериологической, системе, инактивированные в день постановки реакции;
д) 2,5% взвесь эритроцитов барана от осадка на физиологическом растворе (1 :40);
е) физиологический раствор 0,85 о/о химически чистой поваренной соли в дестиллированной воде.
Титрация компонентов реакции
Перед постановкой реакции производят подтитровку, компонентов её: гемолизина, бруцеллёзного антигена и комплемента в гемолитической и бактериологической системах.
Титрация гемолизина
Гемолизин титруют в следующих разведениях—из основного разведения 1:100 готовят разведения гемолизнна 1:500; 1:1000; 1:1500; 1:2000; 1 :2500; 1 :3 000; 1:3500 и т. д.
Выпускаемый биофабриками гемолизин консервируют 1 :1 глицерином. Поэтому при приготовлении основного разведения 1 :100 берут 0,2 гемолизина и 9,8 физиологического раствора. При консервировании комплемента фенолом разведение его 1 :100 получается при взятии 0,1 комплемента на 9,9 физиологического раствора.
Комплемент входит в реакцию в разведении 1 :20 по 0,5 см8, эритроциты барана—в 2,5 % взвеси из осадка по 0,5 см3. Взамен бруцеллёзного антигена и сыворотки в пробирки прибавляют по 1 см3 физиологического раствора. Продолжительность реакции — 10 минут в водяной бане при 37—38° С.
Титром гемолизина считается наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,5 см3 взвеси эритроцитов при комплементе 0,5 см3 в разведении 1 :20.
В качестве рабочей дозы гемолизина для дальнейших титрации комплемента, бруцеллёзного антигена, а также для реакции по испытанию подозрительных по бруцеллёзу сывороток животных (в главном опыте) берут удвоенный титр гемолизина. Например, если титр гемолизина при его подтитровке был равен 1 :2 000, то в главном опыте берут разведение его 1 :1 000.
При титрации гемолизина ставят следующие контроли:
а) контроль гемолизина (т. е. гемолизин 1 :10 +эритроциты +физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии комплемента);
б) контроль комплемента (т. е. комплемент +эритроциты +физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии гемолизина);
в) контроль физиологического раствора (т. е. эритроциты + физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии гемолизина и комплемента).
Во всех указанных контролях гемолизин эритроцитов должен отсутствовать.
Титрация комплемента в гемолитической системе
Комплемент исследуется в дозах: 0,1; 0,13; 0,16; 0,19 и т. д. с интервалом в дозировке по 0,03 до 0,49 комплемента в разведении 1:20. В каждую пробирку недостающее до 0,5 количество разведённого комплемента доливают физиологическим раствором
Схема титрации комплемента в гемолитической системе
|
Комплемент в разведении 1:20 |
0,1 |
0,13 |
0,16 |
0,19 |
0,22 |
0,25 |
0,28 |
0,31 |
0,34 |
0,37 |
0,40 |
0,43 |
0,46 |
0,49 |
|
Недостающее количество физиологического раствора…….. Эритроциты барана из разведения 1:40……………………….. Гемолизин в рабочем титре… Физиологический раствор вместо антигена и сыворотки.. |
0,40 0,5 0,5 1,0 |
0,37 0,5 0,5 1,0 |
0,34 0,5 0,5 1,0 |
0,31 0,5 0,5 1,0 |
0,28 0,5 0,5 1,0 |
0,25 0,5 0,5 1,0 |
0,22 0,5 0,5 1,0 |
0,19 0,5 0,5 1,0 |
0,16 0,5 0,5 1,0 |
0,13 0,5 0,5 1,0 |
0,1 0,5 0,5 1,0 |
0,07 0,5 0,5 1,0 |
0,04 0,5 0,5 1,0 |
0,01 0,5 0,5 1,0 |
Водяная баня 10 минут при 37—38° С.
(в первую пробирку 0,4 физиологического раствора, во вторую 0,37 и т. д.).
Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,5 см3 взвеси эритроцитов при вытитрованной рабочей дозе гемолизина в течение 10 минут в водяной бане при 37—38° С.
Титрация комплемента в бактериологической системе
Компоненты: 1) Заведомо положительные бруцеллёзные сыворотки (давшие 4 и 2 креста), консервированные 0.5% карболовым физиологическим раствором (на 9,0 сыворотки 1,0 раствора).
2) нормальные сыворотки крупного рогатого скота или овец. Бруцеллёзные и нормальные сыворотки наливают в пробирки по 0,05+0,45 физиологического раствора или делают разведение их 1 :10, и разливают в пробирки по 0,5. Бруцеллёзные и нормальные сыворотки в разведённом виде 1:10 инактивируются. Дозы комплемента из основного разведения 1 :20 берут на два интервала ниже против титра его в гемолитической системе, т. е. если тигр комплемента в гемолитической системе 0,25, то и титрация комплемента в бактериологической системе производится в дозах—0.19; 0,22; 0,25; 0,28 и т. д.
Каждое разведение комплемента ставится с контролем без антигена. Во все пробирки до недостающей 0,5 дозы комплемента добавляют физиологический раствор.
После разливки по пробиркам нормальных и бруцеллезных сывороток, бруцеллёзного антигена в титре и комплемента в соответствующих дозах—пробирки ставят на 20 минут в водяную баню при 37—38°С. Затем в них добавляют по 0,5 гемолизина в рабочем титре и по 0,5 см3 2,5 °/о взвеси эритроцитов барана. Продолжительность реакции гемолитической системы в водяной бане—20 минут.
Схема титрации комплемента в бактериологической системе
|
Комплемент в разведении 1:20 |
0,19 |
0,22 |
0,25 |
0,28 |
0,31 |
0.34 |
0,37 |
0,40 |
0,43 |
0,46 |
0,49 |
|
Недостающее количество физиологического раствора |
|||||||||||
|
0,31 |
0,28 |
0.25 |
0,22 |
0,19 |
0,16 |
0,13 |
0,1 |
0,07 |
3,04 |
0,01 |
|
|
Антиген в удвоенном его титре…… |
|||||||||||
|
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
|
Нормальная сыворотка 1 : 10 …….. |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
Эритроциты барана 1:40 …….. |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0.5 |
|
Гемолитическая сыворотка в рабочем титре. . |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Водяная баня 20 минут при 37—38° С.
Титр комплемента—минимальное количество его, потребное для полного гемолиза взвеси эритроцитов в пробирках с нормальными сыворотками, с антигеном и без антигена, при соответствующей задержке гемолиза в бруцеллёзной сыворотке с антигеном при 37.—38°С в течение 20 минут.
Титрация бруцеллёзного антигена
1. Для титрации бруцеллёзного антигена берут две бруцеллёзные сыворотки, содержащие различное количество комплементсвязывающих веществ (давшие 4 и 2 креста).
2. Одну нормальную сыворотку.
Бруцеллёзные и нормальную сыворотки предварительно инактивируют в разведении 1 :10.
Для титрации антигена бруцеллёзные сыворотки разводят следующим образом:
Разведение 1,0 сыворотки +9,0 физиологического раствора равно 1:10
» 0,4 » +9,60 » » » 1:25
» 0,20 » +9,80 » » » 1:50
» 0,13 » +9,87 » » » 1:75
» 0,1 » +9,9 » » » 1 : 100
Комплемент, гемолизин и эритроциты—в рабочих титрах. Температура водяной бани и время реакции обычные.
Схема реакции следующая:
|
Разведение антигена |
1:10 |
1:50 |
1: 100 |
1:150 |
1:200 |
1 :300 |
1:400 |
1 :500 |
|
Антиген |
0,5 |
0.5 |
0,5 |
0,5 |
0 5 |
0 5 |
0,5 |
0,5 |
|
Одно разведение сыворотки….. |
— |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
Комплемент…. Физиологический раствор……. |
0,5 0,5 |
0,5 — |
0,5 — |
0,5 — |
0,5 — |
0,5 — |
0,5 — |
0,5 — |
|
Водяная баня 20 минут при 37—38° С. |
||||||||
|
Гемолизин….. |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
Взвесь эритроцитов. |
0,5 |
0.5 |
0,5 |
0,5 |
0 5 |
0 5 |
0,5 |
0,5 |
По этой схеме ставят и все остальные разведения сыворотки. Нормальную сыворотку берут в первом и втором разведенных. Контроль на антиген—пробирка с антигеном без сыворотки.
Примерный результат реакции
Определение производится в процентах гемолиза и по осадку эритроцитов.
|
Разведение антигена |
1 :10 |
1 :50 |
1 :100 |
1:150 |
1:200 |
1 :300 |
1 :400 |
1 :500 |
|
Разведение 1) сыворотки 2) 3) 4) 5) |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
10 |
20 |
40 |
|
0 0 10 |
0 0 10 |
0 0 10 |
0 0 0 |
0 10 10 |
10 20 40 |
30 40 60 |
60 60 100 |
|
|
10 |
20 |
20 |
10 |
40 |
100 |
100 |
100 |
Наибольшая задержка гемолиза в сильно разведённых бруцеллёзных сыворотках произошла с разведением антигена 1 :150. Это разведение и является рабочим титром антигена. Титром антигена считается то разведение его, которое даёт наибольшую задержку гемолиза с разведёнными бруцеллёзными сыворотками разной активности.
Антиген должен быть прозрачным. Результаты титрации антигена записывают в лабораторную книгу. Раз протитрованный антиген можно использовать в реакции в том же титре в течение 2—3 месяцев, в то время как остальные компоненты реакции подтитровываются перед каждой её постановкой.
Главный опыт
Разведение комплемента для главного опыта. Допустим, что надо исследовать 100 пробирок с сывороткой. Титр комплемента в бактериологической системе 0,3 в разведении 1 :20. Следовательно, в каждой пробирке чистого комплемента содержится 0,015 (0,3:20== ===0,015, 0,015Х100== 1,5 см3 чистого комплемента и 48,5 см3 физиологического раствора).
Основные условия постановки главного опыта. Общий объём компонентов реакции 2,5 см3. Исследуемые сыворотки инактивируются в водяной бане (крупного рогатого скота и свиней при 56—57°С, лошадей и овец при 58-590С в течение 30 минут).
Титрацию комплемента в бактериологической системе производят с сыворотками того вида животных, сыворотки которых исследуются в главном опыте.
Испытуемые сыворотки исследуют в дозах 0,1 и 0,05. Контроль без антигена ставят с сывороткой в дозе 0,1. Время связывания в бактериологической системе 20 минут, реакция продолжается 20 минут.
Контроли главного опыта. 1. Нормальная и бруцеллёзная сыворотки с антигеном и без антигена в дозах 0,05.
2. Антиген в двойной дозе без сыворотки.
3. Контроли гемолитической системы.
Оценка результатов реакции
Официальной диагностической дозой сыворотки, по которой даётся результат, является 0,05. Доза сыворотки 0.1 является вспомогательной контрольной. Результат реакции оценивают два раза. Первый раз тотчас после водяной бани, второй—через 12 часов стояния проб при комнатной температуре. Результаты реакции отмечают крестами:
положительная реакция…………………………………………….4 креста (++++),
сомнительная » …………………………………………….2 и 1 крест (++) и (+)
отрицательная » …………………………………………….знаком минус (-)
Степень задержки, выраженная крестами, соответствует следующим процентам гемолиза эритроцитов:
1) 4 креста — гемолиз эритроцитов ………………………..от 0 до 10%
2) 3 » » » ……………………….. » 10 » 40%
3) 2 » » » ……………………….. » 40 » 70%
4) 1 крест » » ………………………… » 70 » 90%
5) минус » » ………………………… » 90 » 100%
Результаты исследования сообщаются словами: положительная, сомнительная, отрицательная реакция с указанием количества крестов. Данные всех титрационных опытов и особенностей реакции заносятся в дневник серологических исследований лаборатории.
Для внесения объективного признака в определение результатов реакции крестами и однообразной оценки её в различных лабораториях, рекомендуется производить оценку в процентах гемолиза. Делают это следующим образом: из реакции выбирается 5 пробирок с полным гемолизом, и жидкость сливают в одну пробирку. Эта жидкость указывает на 100% гемолиз. Из неё готовят разведение с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:
|
№ пробирок |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
Гемолизированная жидкость…….. |
0,2 1,8 10 |
0,4 1,6 20 |
0,6 1,4 30 |
0,8 1,2 40 |
1.0 1,0 50 |
1,2 0,8 60 |
1,4 0,6 70 |
1,6 0,4 80 |
1,8 0,2 90 |
|
Физиологический раствор…… |
|||||||||
|
Процент гемолиза. . |
Стандартные пробирки готовят перед учётом реакции. Учёт реакции производят тогда, когда эритроциты осели на дно пробирки. Цвет находящейся над осадком жидкости исследуемой пробирки сравнивается со стандартной пробиркой и процент гемолиза переводят на кресты.
Для более наглядного сопоставления реакций со стандартной жидкостью рекомендуется при изготовлении этого стандарта, не изменяя объёма жидкости, добавлять в каждую пробирку кровяных шариков барана в разведении 1 :40 по следующей схеме:
|
№ пробирок |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
Эритроциты 1 : 40 …….. |
0,45 |
0,40 |
0,35 |
0,30 |
0,25 |
0,20 |
0,15 |
0,10 |
0,05 |
|
Общий объём гемолизированной жидкости…. |
2,05 |
2,10 |
2.15 |
2,20 |
2,25 |
2,30 |
2,35 |
2,40 |
2,45 |
Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, необходимо повторно исследовать. При получении вторично тех же результатов реакцию считают положительной. Если при вторичном исследовании, результат оценивается одним крестом, то реакция считается сомнительной.
При получении сомнительной реакции, вторично берут сыворотку на исследование по РСК через 2—3 недели после первого исследования.