Реакция производится в водяной бане при общем объёме 2,5 см3
Всех компонентов при 37—38°С.
Компоненты реакции
а) гемолизин—рабочий титр не менее 1 :1 000;
б) сапной антиген—экстракт сапного микроба;
в) свежая или консервированная сыворотка морской свинки (комплемент);
г) испытуемая сыворотка и сыворотки (нормальная и санная) для титрации комплемента в бактериологической системе, инактивпрованные в день постановки реакции при температуре 58.—59°С в течение 30 минут.
д) 2,5 °/о взвесь эритроцитов от осадка в физиологическом растворе (1 :40);
е) физиологический раствор 0,85 °/о химически чистой поваренной соли на дестиллированной воде.
Гемолизин и сапной антиген изготовляют централизованно на биофабриках.
Титрация компонентов реакции
Перед реакцией производят титрацию гемолизина и комплемента в гемолитической системе и комплемента в бактериологической системе.
Титра ция гемолизина
При титраций гемолизина делают следующие разведения: 1 :100; (основное разведение); 1; 500; 1:1 000; 1:1 500; 1:2 000; 1:2 500; 1:3000; 1:3500; 1:4000 и т. д.
Если гемолизин консервирован карболовой кислотой, то берут 0,1 гемолизина на 9,9 физиологического раствора (1:100), если же он консервирован глицерином, то следует брать 0,2 см3 гемолизина на 9,8 физиологического раствора (обычно на фабрике и принято консервировать гемолизин глицерином).
Комплемент употребляют в разведении 1 :20 по 0,5 см3 и эритроциты—2,5 °/о взвесь из осадка по 0,5 см3. Взамен сапного антигена и сыворотки лошади в пробирки прибавляют 1 см3 физиологического раствора. Продолжительность реакции—10 минут в водяной бане при 37—38°С. Титр гемолизина—наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,5 см3 взвеси эритроцитов при комплементе 0,5 см3 разведения 1 :20- при 37—38° С в течение 10 минут.
Рабочей дозой гемолизина’ для дальнейших титраций комплемента и сапного антигена, а также для реакции при испытании подозрительных по сапу сывороток (главного опыта) считается удвоенный титр гемолизина.
При титрации гемолизина ставят следующие контроли: 1) контроль гемолизина (т. е. Гемолизкн 1 :100 + эритроциты + физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии комплемента); 2) комплемента (т. е. комплемент + эритроциты +физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии гемолизина и 3) физиологического раствора (т. е. эритроциты + физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии гемолизина и комплемента). Во всех контрольных пробирках гемолиз эритроцитов отсутствует. Для дальнейшей работы допускается смешивание гемолизина и эритроцитов в одинаковых объёмах.
Титрация комплемента в гемолитической системе
Комплемент исследуют в таких дозах; 0,1; 0,13; 0,16; 0,19; 0,22 и т. д. с интервалами по 0,03 до 0,49 комплемента в разведении 1 :20. В каждую пробирку до недостающего количества (объёма) в 0,5 см3 доливают физиологический раствор (в первую пробирку 0,4 см3 физиологического раствора, во вторую—0,37 см3 и т. д.).
Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее количество, потребное для полного гемолиза 0,5 см3 взвеси эритроцитов при вытитрованной дозе гемолизина в течение 10 минут в водяной бане при 37—38°С.
Титрация комплемента в бактериологической системе
Компоненты: сапные сыворотки ++++ и ++, консервированные 5% карболово-физиологическим раствором (на 9,0 сыворотки 1,0 раствора), нормальные сыворотки—2. Сыворотки берут той же давности, что и испытуемые.
Сапные и нормальные сыворотки наливают в пробирки по 0,05 и добавляют 0,45 физиологического раствора (или делают разведение 1 :10 и разливают по пробиркам по 0,5). Разведение комплемента из основного разведения (1 :20) начинается на 2 интервала ниже против титра его в гемолитической системе: если титр комплемента в гемолитической системе 0,25, то разведение начинается с 0,19; 0,22; 0,25; 0,28 и т. д. Каждое разведение комплемента ставится с контролем без антигена. Во все пробирки до недостающей 0,5 см3 дозы комплемента добавляют физиологический раствор.
После разливки нормальных и сапных сывороток, сапного антигена в титре и соответствующих доз комплемента пробирки ставят на 20 минут и водяную баню при 37°С, после чего в них наливают по 0,5 см3 гемолизина в рабочем титре и 0,5 см3 эритроцитов барана (2,5 о/о взвесь). Время реакции в гемолитической системе—20 минут.
Титр комплемента—минимальное количество его, потребное для полного гемолиза взвеси эритроцитов в пробирках с нормальными сыворотками с антигеном и без антигена, и с сапной сывороткой без антигена, при соответствующей задержке гемолиза в сапной сыворотке с антигеном при 37°С в течение 20 минут.
Разведение комплемента для главного опыта
Допустим, что надо исследовать 100 пробирок. Титр комплемента в бактериологической системе 0,3, разведение 1 ; 20. Следовательно, в каждой пробирке чистого комплемента имеется 0,015, т. е, 0,3 :20 ==0,015.
0,015Х100== 1,5 чистого комплемента и 48,5 физиологического раствора.
Антиген применяют в титре, установленном биофабрикой. При получении новой партии титр проверяется на известных сапных и нормальных сыворотках по приведённой ниже схеме.
Главный опыт
Испытуемые сыворотки исследуются в дозе 0,05. Контроля без антигена в дозе 0,1. Инактивируются сыворотки с физиологическим раствором при 58—59° С 30 минут. Время связывания бактериологической системы в водяной бане—20 минут, реакция—20 минут.
Сыворотки, обнаружившие ту или иную степень задержки гемолиза, проверяются вторично в дозах 0,1 и 0,05, с контролем в дозе 0,1.
При массовых исследованиях разрешается производить первую реакцию, с сывороткой без контроля (сыворотки без антигена).
Основные контроли. главного опыта. 1. Нормальные и сапные сыворотки с антигеном и без антигена в дозах 0,05.
2. Антиген в двойной дозе без сыворотки.
3. Контроли гемолитической системы.
4. Оценка результатов реакции.
Официальной диагностической дозой сыворотки, по которой даётся результат, является 0,05 см3 для реакции, производящейся в объёме 0,5 см3. Доза 0,1 см3 является вспомогательно-контрольной. Результат реакции оценивается два раза. Первый раз тотчас после водяной бани, второй—через 12 часов стояния проб при комнатной температуре. Оценка выражается крестами по следующей схеме:
а) положительная реакция ……………………………..++++ +++ ++±
б) сомнительная » …………………………….. ++ +
в) отрицательная » …………………………….. —
Степени задержки, выражаемые крестами, соответствуют следующим процентам гемолиза эритроцитов:
++++ гемолиз эритроцитов ……………………….от 0 до 10%
+++ » » ………………………. » 10 » 40%
++± » » ……………………….. » 40 » 50%
++ » » ………………………… »50 » 70%
+ » » ……………………….. » 70 » 90%
— » » …………………………» 90 » 100%
Результат исследования сообщается словами: положительная, отрицательная, сомнительная реакция, с указанием количества крестов. Данные всех титрационных опытов и особенностей реакции вносятся в дневник серологических работ лаборатории.
Для внесения объективного признака в определение результата реакции крестами и однообразной оценки её в различных лабораториях, рекомендуется производить оценку в процентах гемолиза. Это делают так: из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость сливают в одну пробирку. Жидкость эта означает 100 о/о гемолиза. Из неё готовят разведения с меньшими процентами гемолиза следующим образом:
|
№ пробирок |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
Гемолизированная жидкость |
0 2 |
0 4 |
0,6 |
0,8 |
1,0 |
1,2 |
1,4 |
1,6 |
1,8 |
|
Физиологический раствор……… Процент гемолиза. . . |
1,8 10 |
1,6 20 |
1,4 30 |
1,2 40 |
1,0 50 |
0,8 60 |
0,6 70 |
0,4 80 |
0,2 90 |
Стандартные пробирки приготовляют перед учётом реакции. Учёт производят тогда, когда эритроциты осели на дно пробирки. Цвет исследуемой жидкости сравнивают с цветом жидкости, находящейся над осадком в стандартной пробирке; процент переводят в кресты.
Для более наглядного сопоставления реакции со стандартной жидкостью гемолиза рекомендуется при изготовлении этого стандарта, не изменяя объёма жидкости, в каждую пробирку добавить кровяных шариков барана в разведении 1 :40 по следующей схеме:
|
№ пробирок |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
2,5% взвесь эритроцитов……… |
|||||||||
|
0,45 |
0,40 |
0,35 |
0,30 |
0,25 |
0,20 |
0 15 |
0,10 |
0,05 |
|
|
Общий объём гемолизированной жидкости. |
|||||||||
|
2,05 |
2,10 |
2,15 |
2,20 |
2,25 |
2,30 |
2,35 |
2,40 |
2,45 |
Титрация сапного антигена
1. Для титрации берут две сапные сыворотки различной силы ( ++++ И ++).
2. Одну нормальную сыворотку.
Сапные сыворотки предварительно разводят следующим образом:
Разведение 10 см3 сыворотки +9,0 см3 физиологического раствора равно 1: 10
0,4 » +9,60 » » » 1:25
0,20 » + 9,80 » » » 1 :50
0,13 » +9,87 » » » 1:75
0,1 » +9,9 » » » 1:100
Комплемент, гемолиэин и эритроциты—в рабочих титрах; температура водяной бани и время— обычные.
|
Гемолизин. |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
Взвесь эритроцитов…. |
|||||||||
|
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
20 минут в водяной бане при 38°С.
По этой схеме ставят остальные разведения сыворотки, В случае, если сыворотка даёт +, ++, +++, то достаточно первых трёх разведений.
Нормальную сыворотку берут в (первом и третьем разведении, контроль на антиген, пробирку с антигеном без сыворотки 1 :10.
Примерный результат реакции следующий: (определение произведено в процентах гемолиза и по осадку эритроцитов):
|
Разведение антигена |
1 :10 |
1 :50 |
1 :100 |
1:150 |
1:200 |
1 :300 |
1 :400 |
1 :500 |
|
Разведение 1) сыворотки 2) 3) 4) 5) |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
10 |
20 |
40 |
|
0 0 10 |
0 0 10 |
0 0 10 |
0 0 0 |
0 10 10 |
10 20 40 |
30 40 60 |
60 60 100 |
|
|
10 |
20 |
20 |
10 |
40 |
100 |
100 |
100 |
Наибольшая задержка гемолиза у сильно разведённых сывороток получилась с разведением антигена 1 :100. Это разведение и является рабочим титром антигена. Титром антигена считается то разведение его, которое даёт наибольшую задержку гемолиза с разведенными сапными сыворотками разной активности.
Антиген должен быть прозрачным. Результаты титрации заносят подробно в лабораторную книгу.