Химико-токсикологический анализ в ветеринарной токсикологии имеет решающее значение. При установлении диагноза на отравление, изучении миграции токсических веществ в объектах окружающей среды и организме животных, проведении ветеринар-но-санитарной оценки кормов и продуктов питания используют, как правило, только химико-аналитические методы исследования, Особенно их значение возросло за последние годы, когда стали уделять особое внимание охране окружающей среды, в системе которой большое место занимает мониторинг — накопление фактических данных по уровню загрязнения объектов окружающей среды токсическими веществами различного происхождения.
По данным Гунтера (1977), чувствительность аналитически; методов определения пестицидов за 25 лет (1941 —1965) выросла десятки тысяч раз. Если в 1941 г. пределы обнаружения больши ства токсических веществ составляли Юмг/кг, то в 1965г. 0,1 мкг/кг.
В настоящее время для анализа остатков химических веществ в объектах окружающей среды и биологическом материале используют современные физико-химические методы, такие, как тонкослойную и газожидкостную хроматографию, ультрафиолетовую, инфракрасную и атомно-абсорбционную спектрометрию, масс-спектрометрию и хромас-спектрометрию.
Современные методы исследования должны быть по возможности специфичными, т. е. позволяли бы открывать искомое вещество в присутствии других аналогичных соединений, быть достаточно чувствительными и позволяли бы определять миллионные доли вещества в 1 кг субстрата. Особенно это важно для методов, предназначенных для санитарной оценки кормов и продуктов животноводства, а также для изучения динамики остатков пестицидов в воде, растениях и организме животных.
Степень определения химических токсикантов должна составлять не менее 60 % от количества стандартного вещества, внесенного в пробу. Методы должны быть удовлетворительно точными (не менее ± 20 %) и хорошо воспроизводимыми.
Методы определения токсических веществ в патологическом, материале, объектах окружающей среды, кормах и продуктах питания животного происхождения включают в себя выделение токсического вещества из пробы. Выделение яда из пробы может быть проведено путем мокрого или сухого озоления, отгонки с водяным паром или же экстракцией одним или несколькими органическими растворителями.
Сухое озоление проводят под действием высокой температуры 24
(до 500 °С) в муфельной печи. Этот метод в основном используют для выделения металлов.
Мокрое озоление применяют значительно чаще и проводят при помощи концентрированных неорганических кислот, чаще всего смеси азотной, серной кислот и окислителей.
Выделение токсических веществ методом отгонки с водяным паром или дистилляции используют для легколетучих химических соединений. Сущность метода заключается в том, что пробу тщательно измельчают до кашицеобразного состояния или же разрушают неорганической кислотой, разбавляют водой, а затем воду перегоняют, нагревая колбу или подавая в нее пар от парообразователя. Токсические вещества переводятся в дистиллят.
Чаще других в ветеринарной практике выделяют токсические вещества путем их экстракции из пробы органическими растворителями. Для этого пробу тщательно измельчают, помещают в колбу, а затем заливают одним или несколькими органическими растворителями. Объем органического растворителя должен быть не менее чем в 2 раза больше массы или объема пробы. Экстракцию токсиканта проводят путем выдерживания пробы с органическим растворителем в течение 20—24 ч, перемешивания на шюттель-ап-парате в течение 1—2 ч или смешивания в течение нескольких минут при большой скорости вращения перемешивающего устройства (ультратораксы, омнимиксары и др.). Последний способ предпочтителен, так как при этом образуется гомогенная масса, в которой создается наиболее тесный контакт органического растворителя с субстратом, а следовательно, наиболее полно извлекаются токсические вещества, содержащиеся в пробе. Для этой цели также используют аппарат Соксклета, в котором токсическое вещество экстрагируется при многократном промывании субстрата кипящим органическим растворителем. Аппарат Соксклета обеспечивает более полное извлечение токсиканта из пробы по сравнению с другими методами.
При любом способе выделения токсического вещества в экстракт переходит значительное количество примесей, мешающих определению: жиры, пигменты, воск, белки, соли и др. Для освобождения экстракта от этих веществ используют различные способы очистки: путем омыления, вымораживания, осаждения, перераспределения из одного органического растворителя в другой с помощью специальных колонок и др. Последние зависят от вида анализируемого соединения и субстрата, в котором он находится.
Для того чтобы повысить чувствительность метода анализа, экстракты концентрируют до небольшого объема, достаточного для проведения исследований данным методом. Обычно конечные объемы экстрактов составляют 0,5—5 мл. Для концентрирования используют специальные аппараты Кудерна—Данича, вакуумротационные испарители. Концентрирование также можно проводить в токе воздуха или азота. В практических условиях наиболее приемлемым способом является концентрирование в токе воздуха. Для этого экстракт заливают в фарфоровую выпарительную чашку, ставят ее под шторку вытяжного шкафа и включают тягу. При определении высоколетучих веществ при концентрировании возможны значительные потери яда, поэтому при этой операции необходимо выполнять следующие требования: не концентрировать конечные экстракты при повышенной (выше 40 °С) температуре, не упаривать досуха очищенные экстракты.
Индикацию токсичных веществ проводят следующими основными методами.
Биологические методы. Применяют главным образом для определения некоторых пестицидов и микотоксинов. Они основаны на чувствительности низших животных, растений или тканей к действию токсического вещества. Так, к инсектицидам и акарици-дам наиболее чувствительны различные членистоногие. Чаще других для определения ансектоакарицидов используют комнатных мух, мух-дрозофил, личинок комаров и рачков-дафний. Для определения микотоксинов применяют кожные пробы на кроликах или аквариумных рыбах гуппи.
Некоторые из микотоксинов, в частности трихотецены и другие, продуцируемые грибом Fusarium sporotrihioides, обладают очень сильным дерматоцидным действием, поэтому реакция кожи является специфической по отношению к метаболитам этих видов грибов. Из всех позвоночных животных наиболее чувствительны по отношению к большинству токсических веществ рыбы, поэтому их используют для определения не только микотоксинов, но и многих других токсикантов.
Биологические методы индикации обладают высокой чувствительностью, однако в большинстве своем они неспецифичны и не позволяют установить вид токсического вещества. Однако эти методы широко применяют для общей токсикологической оценки кормов при отравлениях животных на первой стадии лабораторного токсикологического исследования. С помощью этих методов можно установить отравление и исключить заболевания другой этиологии.
Биохимические методы. Основаны на подавлении некоторыми токсическими веществами активности отдельных биохимических систем. В ветеринарном токсикологическом анализе наиболее часто применяют ферментный метод определения фосфороргани-ческих и карбаматных инсектицидов. Он основан на том, что соединения этих групп в условиях in vitro подавляют активность хо-линэстеразы. Чувствительность метода при определении некоторых ФОС достигает 0,01—0,001 мг/кг. Однако эти методы обладают групповой специфичностью и позволяют установить всю группу в целом, не давая возможности установить вид ФОС.
Кроме этого некоторые ФОС, в частности производные тио — и ди-тиофосфорных кислот, очень слабо ингибируют активность фермента in vitro и нуждаются в предварительной активации.
Химические методы. Основаны на количественном определении осадка или окрашенного комплекса, образуемого при взаимодействии открываемого вещества с другим химическим соединением. Химические методы анализа, применяемые в ветеринарной токсикологической практике, основаны на осаждении, титрометрии, колориметрии, спектрофотометрии.
Реакция осаждения базируется на образовании нерастворимого в воде осадка при взаимодействии открываемого химического вещества с другим химическими соединением, вводимым в экстракт. По реакции осаждения определяют некоторые алкалоиды, натрия хлорид, ТМТД и другие токсические вещества. Однако методы определения ядовитых веществ этой реакцией имеют низкую чувствительность, недостаточную специфичность и точность, поэтому их применяют ограниченно.
Более широко используют титрометрические методы. Примером может служить определение натрия хлорида при осаждении хлоридов серебра нитратом с последующим титрованием избытка серебра роданидом аммония в присутствии в качестве индикатора железоаммонийных квасцов. Но и титрометрические методы недостаточно чувствительны и утрачивают свое практическое значение в связи с развитием новых, более совершенных способов.
В практике химико-токсикологических исследований находят широкое применение колориметрические методы, основанные на определении интенсивности окраски цветных комплексов, образующихся при взаимодействии открываемого вещества с другим химическим соединением, вводимым в раствор. В последние годы. все чаще используют фотоэлектроколориметрические методы, при которых интенсивность окрашивания цветных комплексов определяют с помощью фотоэлектроколориметра. По чувствительности и точности колориметрические методы превосходят основанные на осаждении и титрометрии способы.
Физико-химические методы. К физико-химическим методам относят различные методы хроматографии (колоночную, бумажную, тонкослойную, газожидкостную и жидкостную), полярографию, ультрафиолетовую и инфракрасную спектрометрию, атомную абсорбцию, методы нейтронно-активационного анализа.
Из хроматографических методов в практике ветеринарно-ток-сикологического исследования наибольшее применение находят тонкослойная и газожидкостная хроматографии (ТСХ и ГЖХ), разработанные русским ученым М. С. Цветом (1903). Эти методы являются одними из основных в аналитической химии. Преимущество их состоит в том, что они обладают высокой специфичностью и чувствительностью и позволяют за один аналитический прием определить сразу несколько химических соединений. Можно сложную смесь химических соединений, содержащихся в анализируемой пробе, разделить на отдельные вещества, а затем каждое из них определить каким-либо химическим или физическим методом.
Тонкослойную хроматографию Наиболее широко применяют в практических лабораториях. Принцип полуколичественного метода состоит в том, что смесь химических веществ, содержащихся в анализируемой пробе, наносят на пластинку и разделяют в тонком слое инертного порошка (селикагель, окись алюминия и др.) с помощью смеси органических растворителей (подвижный растворитель). Пластинку опрыскивают раствором проявляющего реактива, в результате чего на ней появляются в виде окрашенных пятен исследуемые химические соединения. Идентифицируют открытые вещества по величине Rf — частному от деления расстояния, пройденного искомым веществом от точки нанесения (линия старта) до места дислокации, к расстоянию, пройденному подвижным растворителем. Количество открываемого вещества определяют по интенсивности окраски пятна и его размерам.
В практике ветеринарных химико-токсикологических исследований тонкослойная хромотография используется для определения многих пестицидов, алкалоидов, микотоксинов, органических соединений тяжелых металлов. Метод прост по технике использования, не требует сложного оборудования, обладает достаточно высокой специфичностью и чувствительностью (0,05— 1,0 мкг в пробе).
Газовую хроматографию Применяют для одновременного разделения смеси химических веществ, их последующей идентификации и количественного определения. Разделение смеси осуществляют на стеклянных или металлических колонках длиной 1—Зм, заполненных твердым адсорбентом с нанесенной на него жидкой фазой. В качестве последней чаще всего используют высокомолекулярные жидкости с высокой температурой кипения (полиэти-ленгликоли, силиконовые масла и др.). Подвижной фазой служит инертный газ (азот и др.).
Индикацию разделенных химических веществ осуществляют с помощью детектора. В газовых хроматографах, предназначенных для анализа токсических веществ, чаще всего используют детектор электронного захвата (ДЭЗ), термоионный детектор (ТИД), пламенно-фотометрический детектор (ПФД). Абсолютная чувствительность детектирования различных химических соединений достигает 0,01—0,02 нг в пробе, относительная чувствительность-0,1—0,5мкг/кг. В практике химико-токсикологического анализа газовую хроматографию применяют для открытия многих пестицидов, органических соединений ртути, полихлорированных би-фенилов и других токсических соединений. Однако возможности газовой хроматографии далеко не исчерпаны. Газовая хроматография, и в частности ГЖХ, имеет некоторые недостатки: не позволяет прямым способом разделить и идентифицировать вещества, не обладающие летучестью и не способные прямым путем переходить в газообразное состояние.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) основана на том же принципе, что и газожидкостная, с той лишь разницей, что разделение вещества происходит в двух несмешивающихся жидкостях. Одна из них — обычно высокомолекулярная неполярная жидкость —служит неподвижной фазой, вторая — низкомолекулярная — подвижной. Подвижную фазу под высоким давлением пропускают через неподвижную, в результате чего сложная смесь разделяется на отдельные соединения. С помощью ВЭЖХ можно разделить твердые и жидкие смеси, не превращая их в газообразное состояние, как это бывает при ГЖХ.
Недостаток этого метода — ограниченное число детектирующих систем. Серийные жидкостные хроматографы, выпускаемые отечественными фирмами, оборудованы лишь одним детектором — спектрофотометром.
Спектральные методы. Наибольшее применение в практике анализа токсических веществ получила ультрафиолетовая спектрометрия. Принцип работы ультрафиолетового спектрофотометра основан на поглощении растворами химических веществ лучей в ультрафиолетовом спектре. Этот метод принципиально отличается от фотоэлектроколориметрического тем, что оптическая плотность анализируемых экстрактов измеряется в ультрафиолетовой области спектра.
Инфракрасная спектрометрия Основана на поглощении химическим веществом лучей в инфракрасной области спектра. Степень поглощения неодинакова у разных структурных групп химического вещества, поэтому инфракрасная спектрограмма представляет собой конгломерат пиков с большим количеством вершин. Инфракрасную спектрометрию, как правило, не используют для определения микроколичеств химических веществ в биологических субстратах, а применяют главным образом для расшифровки структуры выделенного химического вещества.
Атомно-абсорбционная спектрометрия Основана на поглощении отдельными атомами химических элементов световых лучей в определенной области спектра. Поэтому исследуемые химические вещества вначале минерализуются, а затем в состоянии раствора подвергаются воздействию лучами определенной длины, соответствующей поглощающей способности того или иного элемента. По степени поглощения лучей определяют его количественное содержание. Этот метод находит широкое применение главным образом при определении металлов и металлоидов (ртуть, свинец, Кадмий, медь, цинк и др.).
Нейтронно-активационный анализ Основан на облучении пробы Нейтронами, в результате чего возникает наведенная радиация, по степени которой и определяют количественный уровень содержания исследуемого элемента. Однако метод требует сложного оборудования, поэтому малоприемлем в практических условиях.