После идентификации возбудителя заболевания и выделения чистой культыры Actinomyces bovis, нашей следующей задачей являлось определение чувствительности возбудителя актиномикоза Actinomyces bovis к антибактериальным препаратам и установление его минимальнуй концентрации, угнетающей рост выделенной культуры этого микроорганизма.
С целью выяснения возможности применения наиболее эффективных антибиотиков при лечении актиномикоза крупного рогатого скота нами было изучено фунгистическое действие антибактериальных препаратов в инъекционных формах, таких как цефтриаксон (цефолоспорины ΙΙΙ поколения), бровасептол (сульфаниламидные препараты), а также препарат фторхинолонового ряда – энрофлокс.
Бровасептол. БРОВАСЕПТОЛ® для инъекций
Описание. Однородный порошок светло-желтого цвета со слабым специфическим запахом в комплекте с флаконом стерильного растворителя (раствор хлорида натрия 0,9%).
Состав. 1 мл3 препарата (готового инъекционного раствора) содержит действующие вещества:
— сульфадиметоксина натриевая соль — 100 мг;
— сульфадиазина натриевая соль — 100 мг;
— триметоприм — 40 мг.
Растворитель — раствор хлорида натрия 0,9%.
Фармакологические свойства. Механизм действия сульфаниламидов и триметоприма заключается в блокировке двух разных этапов биосинтеза фоллиевой кислоты. Это приводит к подавлению роста бактерий, прекращению их размножения и гибели.
Комбинация двух сульфаниламидов и производного диаминопиримидина (триметоприма) дает синергический эффект, что расширяет антимикробный спектр действия препарата. Бровасептол® для инъекций активен против грамположительных (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp. и др.) и грамотрицательных микроорганизмов (Е. coli, Salmonella spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Pasteurella spp., Bordetella spp. и др.). К препарату чувствительны некоторые виды простейших (Pneumocystis carinii, Coccidia и Toxoplasma). Комбинация сульфаниламидов и триметоприма уменьшает вероятность появления резистентных форм патогенной микрофлоры.
Показания. Лечение крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, собак, котов, кроликов и птицы при заболеваниях бактериальной этиологии:
— органов дыхания (ангины, трахеита, фарингита, бронхопневмоний, плеврита);
— органов пищеварения (гастроэнтерита, диспепсии, колибактериоза);
— мочеполовых органов (послеродового сепсиса, цистита, пиелита, уретрита, эндометрита):
— маститов;
— специфических инфекций (актиномикоза, дизентерии, диплококкоза, рожи, энтеротоксемии, эймериоза, пастереллеза, пуллороза, отечной болезни, респираторного микоплазмоза, сальмонеллеза), а также послеоперационных осложнений.
Дозы и способ применения. Внутримышечно в дозе:
— крупный рогатый скот, овцы, свиньи, собаки больших пород — 0,6 — 0,8 мл на 10 кг м. ж.;
— собаки средних и мелких пород, коты — 0,10 — 0,15 мл3 на 1 кг м. т.;
— птица, кроли: внутримышечно — 0,1 мл3 на 1 кг м. ж. или орально с водой — 1 мл3 на 1 л воды.
Молодняку и мелким животным в одно место инъекции следует вводить не более 10 мл3, а взрослым животным — 20 мл3 препарата.
Во всех случаях применения Бровасептола® первую дозу препарата надо увеличивать на 30-100% (в зависимости от хода заболевания). Препарат вводят 1-2 раза с интервалом 24 — 36 часов.
Противопоказания. Повышенная чувствительность к компонентам препарата.
Предостережения. Для разведения не применять раствор новокаина.
Убой животных и птицы на мясо разрешается через 10 суток после последнего применения препарата. Употребление в пищу яиц и молока людям разрешается через 4 дня после последнего применения препарата. К указанному сроку мясо, молоко и яйца скармливают непродуктивным животным или утилизируют (в зависимости от заключения ветврача).
Козы имеют повышенную чувствительность к сульфаниламидам, поэтому раствор препарата следует давать им с особенной осторожностью.
Энрофлокс 5%. Антибиотик относится к группе фторхинолоновых препаратов. Это группа наиболее современных антибиотиков с широким спектром антибактериальной активности. Они активны в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Являясь нетоксичными и очень эффективными препаратами, фторхинолоны играют важнейшую роль при лечении в первую очередь тяжёлых, угрожающих жизни, инфекций. Недостаточная активность препаратов этого ряда в отношении анаэробов легко компенсируется применением их в сочетании с метронидазолом, спектр антибактериального действия которого охватывает анаэробную микрофлору. Такая комбинация высокоэффективна при лечении тяжёлых заболеваний.
Фармакологические свойства Тормозит активный фермент гиразу, который принимает участие в катализе ДНК микробной клетки, в результате чего наступает быстрое бактерицидное действие, особенно на микроорганизмы, резистентные к β-лактамным антибиотикам, тетрациклинам, макролидам и аминогликозидам. Препарат эффективен против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
Цефтриаксон. Относится к препаратам цефалоспоринового ряда. Цефалоспорины обладают широким спектром антимикробного действия. Они активны как в отношении грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Многие антибиотики цефалоспоринового ряда высокоактивны в отношении анаэробов. В сравнении с антибиотиками пенициллиновой группы все цефалоспорины обладают высокой устойчивостью к лактамазам микробной клетки. Они обладают бактерицидным действием, связанным с ингибированием биосинтеза клеточной мембраны бактерий [ ]. Цефалоспорины делятся на четыре поколения. В нашей клинике применялись следующие препараты:
I поколение: цефазолин. Обладает средним спектром действия. Не активен в отношении анаэробов и протея.
II поколение: цефамандол, цефуроксим. Обладают широким спектром действия. Активны в отношении анаэробов и протея. Цефуроксим подобно линкомицину обладает свойством накапливаться в костной ткани и применяется при лечении костных патологий.
III поколение: цефотаксим, цефоперазон, цефтазидим, цефтизоксим, цефтриаксон. Обладают широким спектром действия. Активны в отношении анаэробов, протея. II и III поколение весьма эффективны по отношению к лептоспирам, что в сочетании с их низкой токсичностью выгодно отличает их от стрептомицина. При заболевании спинного и головного мозга концентрация цефуроксима достигает 88% от концентрации в плазме крови (для сравнения, у пенициллина-5%) [ ]. Цефтриаксон – это полусинтетический антибиотик группы β-лактамов, цефалоспорин III поколения, имеет бактерицидный эффект, механизм действия которого связан с угнетением активности фермента трансептидазы, нарушением биосинтеза пептидогликана клеточной стенки микроорганизма. Препарат имеет широкий спектр действия: активен относительно аэробных грамположительных микроорганизмов, факультативных анаэробов, грамотрицательных микроорганизмов.
Причиной выбора именно этих препаратов послужило следующее:
Данные препараты являются одними из последних в своей группе;
Все они обладают довольно широким спектром деятельности против микроорганизмов, таких как E. Coil, Haemophilus, Klеbsiella, Pasteurella, Pseudomonas, Bordetella, Campylobacter, Erysipelothris, Corinebacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Actinobacillus, Bacteroides, Clostridium, а также микоплазм.
Эти препараты относительно редко применяются в хозяйстве, поэтому степень привыкания патогенной и условнопатогенной микрофлоры сводится к минимальной.
Из антибактериальных препаратов in vitro готовили рабочие разведения таким образом, чтобы в первой пробирке концентрация препарата составила 400 мкг/мл3; во второй – 200 мкг/мл3; в третьей – 100 мкг/мл3; в четвёртой — 50 мкг/мл3; в пятой – 25 мкг/мл3; в шестой – 12,5 мкг/мл3.
Также материалом для исследований служила 4-х суточная бульонная культура возбудителя заболевания, которая была выделена от лабораторных животных (белые мыши) в результате проведения ряда опытов по экспериментальному воспроизведению актиномикоза крупного рогатого скота. Бульонную культуру разводили в физиологическом растворе до концентрации микробных клеток 5×106 /мл3. Помимо бульонной культуры, в опыте также использовался нативный материал, который был получен из актиномикомы коровы, больной актиномикозом. Содержимое актиномикозного узла исследовали, как на присутствие самого возбудителя непосредственно, так и на сопутствующую микрофлору, которая, практически, всегда присутствует в содержимом патологического материала.
Для определения чувствительности возбудителя заболевания использовали метод серийных разведений на плотной питательной среде [ ]. В качестве питательной среды применяли агар Сабуро. Приготовленный основной раствор антибиотиков разводили в плотной питательной среде. Для этого расплавленный и охлаждённый до 55˚С агар разливали по 18 мл3 в широкие колбы и сюда же добавляли по 2 мл3 соответствующего разведения испытуемого антибиотика, тщательно перемешивали и переливали в чашки Петри. В контрольную чашку Петри раствор антибиотиков не добавлялся. После подсушивания в термостате в течении 1-го часа на поверхность питательной среды проводили посев культуры и нативного материала с помощью бактериальной петли. Результаты поставленных опытов учитывали через 72 ч инкубации при 37ºС. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика определяли как самую низкую (в микрограммах-милилитрах), полностью угнетающую рост культуры Actinomyces bovis.
Результаты проведённых исследований, представленные в таблицах 3.8; 3.9; 3.10. показывают, что культура Actinomyces bovis оказалась высокочувствительной к Энрофлоксу 5%. Минимальная подавляющая концентрация данного препарата составила 12,5 мкг/мл3, в несколько меньшей степени к бровасептолу, МПК которого составила от 25 мкг/мл3 до 50 мкг/мл3. И наименьшая чувствительность культуры оказалась к цефтриаксону – от 200 мкг/мл3 до 400 мкг/мл3 .
На тех питательных средах, где отмечался рост выделенной культуры, колонии были бесцветные, со временем приобретали кремовато-белый цвет с коричневым оттенком. Отмечали также кожисто-бугристые колонии с ровными и волнистыми краями, и, в редких случаях – присутствием белого воздушного мицелия.
Таблица 3.8
Определение минимальной подавляющей концентрации Энрофлокса 5% для выделенной культуры Actinomyces bovis
|
Кол-во посевов |
Кол-во дней |
Концентрация энрофлокса 5%, мкг/мл3 |
|||||
|
400 |
200 |
100 |
50 |
25 |
12,5 |
||
|
Ι посев |
1 |
— |
— |
— |
— |
— |
— |
|
2 |
— |
— |
— |
— |
— |
— |
|
|
3 |
— |
— |
— |
— |
— |
+ |
|
|
ΙΙ посев |
1 |
— |
— |
— |
— |
— |
— |
|
2 |
— |
— |
— |
— |
— |
— |
|
|
3 |
— |
— |
— |
— |
— |
+ |
|
|
ΙΙΙ посев |
1 |
— |
— |
— |
— |
— |
|
|
2 |
— |
— |
— |
— |
— |
+ |
|
|
3 |
— |
— |
— |
— |
— |
+ |
Примечание: «-» — отсутствие роста на питательных средах;
«+» — наличие роста на питательных средах.
Как видно из таблицы 3.8 в результате действия энрофлокса рост колоний актиномицетов начал появляться лишь на третий день наблюдения при минимальной концентрации препарата 12,5 мкг/мл3 .
Таблица3.9
Определение минимальной Подавляющей концентрации Бровасептола Для выделенной культуры Actinomyces bovis
|
Кол-во посевов |
Кол-во дней |
Концентрация бровасептола, мкг/мл3 |
|||||
|
400 |
200 |
100 |
50 |
25 |
12,5 |
||
|
Ι посев |
1 |
— |
— |
— |
— |
— |
— |
|
2 |
— |
— |
— |
— |
— |
+ |
|
|
3 |
— |
— |
— |
+ |
+ |
+ |
|
|
ΙΙ посев |
1 |
— |
— |
— |
— |
— |
— |
|
2 |
— |
— |
— |
— |
— |
+ |
|
|
3 |
— |
— |
— |
— |
+ |
+ |
|
|
ΙΙΙ посев |
1 |
— |
— |
— |
— |
— |
|
|
2 |
— |
— |
— |
— |
+ |
+ |
|
|
3 |
— |
— |
— |
+ |
+ |
+ |
Примечание: «-» — отсутствие роста на питательных средах;
«+» — наличие роста на питательных средах.
Из таблицы 3.9 видно, что бактерицидное действие бровасептола на культуру Actinomyces bovis слабее чем у энрофлокса. Рост актиномицетов отмечался уже со второго дня при концентрации препарата 12,5 мкг/мл3. Рост колоний возбудителя наблюдался и на третий день при концентрации 50 мкг/мл.3 .
Таблица 3.10
Определение минимальной Подавляющей концентрации ЦефтрИаксона для выделенной культуры Actinomyces bovis
|
Кол-во посевов |
Кол-во дней |
Концентрация цефтриаксона, мкг/мл3 |
|||||
|
400 |
200 |
100 |
50 |
25 |
12,5 |
||
|
Ι посев |
1 |
— |
— |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
2 |
— |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
3 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
ΙΙ посев |
1 |
— |
— |
— |
— |
— |
+ |
|
2 |
— |
— |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
3 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
ΙΙΙ посев |
1 |
— |
— |
— |
+ |
+ |
+ |
|
2 |
— |
— |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
3 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
Примечание :«-» — отсутствие роста на питательных средах;
«+» — наличие роста на питательных средах.
Исходя из результатов проведенной работы видно, что возбудитель актиномикоза наименее чувствительный к цефтриаксону. Слабая чувствительность культуры Actinomyces bovis к цефтриаксону обуславливается тем, что цефтриаксон относиться к группе β-лактамных антибиотиков. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Bryan L. E. [ ], который установил низкую врачебную чувствительность актиномицетов к β — лактамным, аминогликозидним антибиотикам и тетрациклинам, объясняя это наличием генов антибиотикоустойчивости, локализующихся на хромосоме и плазмидах бактериальной клетки.
В результате проведенных исследований установлено, что наиболее эффективным препаратом, обладающим бактерицидным действием на культуру Actinomyces bovis, является энрофлокс, МПК которого составляет 12,5 мкг/мл3. Наименее эффективным — антибиотик цефтриаксон. МПК в его случае составила 400 мкг/мл3