Методика постановки РСК при перипневмонии крупного рогатого скота

Реакцию ставят в водяной бане при 37 °С в общем объёме 1,25 см3. В целях экономии компонентов, в особенности антигена, объём каждого компонента реакции составляет 0,25 см3.

Компоненты реакции

а) Сыворотка крупного рогатого скота испытуемая, заведомо негативная и позитивная. Инактивируется нагреванием в водяной бане (при 5б—58°С в течение 30 минут.

б) Антиген—из натуральной перипневмонической лимфы.

в) Комплемент—свежая сыворотка морской свинки (лучше от нескольких).

г) Гемолизин (сыворотка кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана). Рабочий титр 1 :1 000 и выше.

д) Эритроциты барана—3 о/о взвесь эритроцитов (из осадка на физиологическом растворе).

е) Физиологический раствор—0,85 о/о химически чистой поваренной соли на дистиллированной воде.

Гемолизин и перипневмонийный антиген изготовляются централизованно на биофабриках.

Титрация компонентов реакции

Титрация гемолизина. При титрации гемолизина переменной величиной является количество гемолитической сыворотки. Рекомендуется применять разведение гемолизина 1 :100 (основное), из которого готовят разведения: 1 :1000, 1 ; 1 500, 1 :2000, 1 :2500, 1:3000, 4:3500; 1:4000 и т. д. до 1:6000.

Если гемолизин консервирован карболовой кислотой, то берут 0,1см3 гемолизина на 9,9 см3 физиологического раствора (1:100); если же он консервирован глицерином, то следует брать 0,2 см3 гемолизина на 9,8 см3 физиологического раствора.

Обычно на фабрике принято консервировать гемолизин глицерином (в отношении 1:1).

Комплемент употребляется в разведении 1 :20 и эритроциты (3о/о взвесь из осадка) поступают в пробирку по 0,25 см3.

Взамен перипневмонийного, антигена и сыворотки испытуемого рогатого скота в пробирку добавляют 0,5 см3 физиологического раствора. Контролями опыта титрации гемолизина являются:

1) контроль гемолизина,

2) „ комплемента,

3) „ эритроцитов в физиологическом растворе.

Опыт ведётся в (водяной бане при температуре 3738° С в течение 10 минут.

Титром гемолизина считается наименьшее количество (наибольшее разведение) его в 1,25 см3, потребное для полного гемолиза 0,25 см3 3 о/о взвеси эритроцитов при комплементе в разведении 1:20 в течение 10 минут в водяной бане при 37—38°С.

Рабочей дозой гемолизина для дальнейших титрации, а также для реакции при испытании подозрительных сывороток (главного опыта) считается удвоенный титр гемолизина.

Пример: Если титр гемолизина 1:3000, то рабочей дозой его считается 1 :1 500.

При точно установленном титре гемолнзина определённой серии, титрация его не обязательна при каждой постановке реакции с испытуемыми сыворотками рогатого скота и проводится через 2- и 3-недельные промежутки.

Титрация комплемента в гемолитической системе

Переменной величиной при титрации является количество комплемента, которое исследуют в таких дозах: 0,05; 0,1; 0,12; 0,15; 0,18; 0,20; 0,22; 0,25 комплемента в разведении 1 :10.

Схема титрации комплемента в гемолитической системе

Комплемент в разведении 1:10

0,05

0,1

0,12

0,15

0,18

0,20

0,22

0,25

Недостающее количество физиологического раствора. .

0,20

0,15

0,13

0,1

0,07

0,05

0,03

Гемолизин в двойном титре.

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

Эритроциты барана…..

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

Физиологический раствор вместо антигена и сыворотки.

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,25 см3 взвеси эритроцитов при вытитрованной дозе гемолиздна в течение 10 минут в водяной бане при 37—38°С.

Титрация комплемента в бактериологической системе

Целью титрации является расчёт дозы комплемента, необходимой для реакции при испытании сывороток рогатого скота (для главного опыта) и изучения действия комплемента в присутствии заведомо негативных и заведомо позитивных перипневмонийных сывороток и

Перипневмонийного антигена.

Комплемент титруется в различных разведениях с определённым между ними интервалом на двух перипневмонийных разной активности сыворотках и двух нормальных с обязательной постановкой контроля самих сывороток (т. е. без антигена).

Сыворотки поступают в реакцию в разведении 1:5 (на физиологическом растворе). Разведение комплемента из основного разведения 1 :10 начинается на два интервала ниже титра, полученного в гемолитической системе. Если титр комплемента в гемолитаческой системе 0,15, то начинают разливку его с 0,1; 0,12; 0,15; 0,18; 0,20; 0,22, 0,25. Каждое разведение комплемента ставят с контролем без антигена.

Схема титрации комплемента в бактериологической системе следующая:

Комплемент в разведении 1 :10 . . .

0,1

0,12

0,15

0,18

0,20

0,22

0,25

Недостающее количество физиологическо-го раствора

0,15

0,13

0,1

0,07

0,05

0,03

Антиген в его титре

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

Сыворотка в разведении 1:5…,

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

Водяная баня при 37—38°С 20 минут.

Эритроциты барана (3%) ……

Гемолизин в рабочем титре….

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

Водяная баня при 37—38°С 15 минут.

Титром комплемента для главного опыта считается минимальное количество его, потребное для полного гемолиза взвеси эритроцитов в присутствии нормальной сыворотки, с перипневмонийным антигеном и без антигена, при соответствующей задержке гемолиза при наличии заведомо позитивной перипневмонической сыворотки в течение 15 минут в водяной бане при 37—38°С. Сама по себе перипневмонийная сыворотка в контрольной пробирке без антигена при данной дозе комплемента не должна давать задержку гемолиза.

Разведение комплемента для главного опыта

Требуется исследовать 100 пробирок. Титр комплемента в бактериологической системе в разведении 1 :10. Следовательно, в каждой пробирке чистого комплемента содержится 0,02 (0,2:10—0,02), 0,02 XI 00 ===2,0 см3 чистого комплемента и 23,0 см3 физиологического раствора.

Титрация антигена

Перипневмонийный антиген применяют в титре, установленном учреждением, изготовившим его, но предварительно титр проверяет лаборатория, ставящая реакцию связывания комплемента.

Для установления титра антигена, последний испытывают на трёх отрицательных и трёх положительных по РСК сыворотках от животных, больных ПВЛ.

Положительные сыворотки должны быть различной активности при исследовании на РСК (++++, +++, ++ ).

Для постановки реакций необходимо пользоваться стандартными сыворотками, выпускаемыми учреждениями, изготовляющими перипиевмонийный антиген.

Испытание антигена производят по квадратной схеме, принципом которой является изучение специфической зоны действия антигена при различных разведениях сывороток.

Титрация антигена производится в 5 рядах пробирок, в каждом последующем ряду испытуется убывающая доза позитивной сыворотки.

Разведение сывороток: 1 :5; 1 :10; 1 ;20; 1 :40; 1 :60.

В каждом ряду соответствующих разведении сыворотки ставят с антигеном в различном разведении. Разведение антигена: 20 о/о; 40о/о; 6Оо/о; 80о/о; 100о/о.

Схема квадратного титрования антигена

1. Сыворотки предварительно разводят следующим образом:

Разведение 2,0 сыворотки + 8,0 физиологического раствора равно 1 :5

» 1,0 » + 9,0 » » 1:10

» 0,5 » +9,5 » » 1:20

» 0,25 » +9,75 » » 1:40

» 0,125 » +9,875 » » 1:80

1. Разведение антигена………

100% 0,25 0,25 0,25

0,25 0,25

80% 0,25 0,25 0,25

0,25 0,25

60% 0,25 0,25 0,25

0,25 0,25

40% 0,25 0,25 0,25

0,25 0,25

20% 0,25 0,25 0,25

0,25 0,25

Антиген……………

Одно разведение сыворотки……

Комплемент в его титре 20 минут в водяной бане при 37—38°С ……

Гемолизин…………..

Эритроциты барана 3% взвесь…..

15 минут в водяной бане.

Одновременно» ставят контроль с нормальными сыворотками 1:5, а также испытывают антиген на самозадерживающие свойства (без сыворотки). По этой схеме ставят и остальные разведения сывороток. Рабочей дозой антигена следует считать количество антигена, дающее наиболее сильную задержку со всеми положительными сыворотками при полном гемолизе с нормальными сыворотками и с той же дозой антигена в отсутствии сыворотки.

Наиболее активным антигенам следует считать антиген с наиболее широкой дозой специфического действий при различных разведениях сыворотки.

Антиген, реагирующий в разведении менее 8.0^/о, для практического применения не допускается.

Главный опыт

Каждая испытуемая сыворотка инактивируется в течение 30 минут при 56—58° С в водяной бане, поступает в реакцию в разведении 1 :5 и разливается в пробирки: в одной—сыворотка исследуется со специфичным перипневмонийным антигеном и другими компонентами бактериологической и гемолитической системы и в другой—со всеми компонентами без антигена для определения самозадерживающих свойств сыворотки.

Бактериологическая система 0,25 см3 испытуемой сыворотки в разведении 1:5+0,25 см3 перипневмонийного антигена в рабочей дозе + 0,25 см3 комплемента в установленной титрацией рабочей дозе связывается в водяной бане при 37—38° С в течение: 20 минут.

После этого в каждую пробирку прибавляют компоненты гемолитической системы: 0,25 см3 гемолизина в рабочей дозе +0,25 см3 взвеси эритроцитов.

Допускается предварительное смешивание эритроцитов и гемолизина.

Реакция главного опыта продолжается в водяной бане 15 минут, после чего производят первый учёт реакции.

При массовом исследовании допускается постановка реакции без контролей (т. е. сыворотки без антигена), но при обязательном повторении исследования во всех случаях положительных и сомнительных реакций с контролем сыворотки на самозадерживающие свойства.

Учёт реакции

Первый учёт реакции производят сейчас же по окончании её, после изъятия пробирок (главного опыта) из водяной бани. Второй учёт реакции производят через 12—18 часов, причём пробирки остаются это время в прохладном месте. После второго учёта окончательно записывают результаты по схеме:

А) положительная реакция. . ++++ +++ ++±

Б) сомнительная » ++ +

В) отрицательная » —

Степени задержки, выражаемые крестами, соответствуют следующим процентам гемолиза эритроцитов:

++++ — гемолиз эритроцитов….. от 0 до 10%

+++ » » …… » 10 » 40%

++:±:(2 ½креста) » » …… » 40 » 50%

++ гемолиз эритроцитов……… от 50 до 70%

+— » » ………. » 70 » 90 %

— » » . ..,….. » 90 » 100%

Результат исследования сообщают словами—положительная реакция, сомнительная, отрицательная, с указанием крестов.

Данные всех титрационных опытов и особенностей реакций вносятся в дневник серологических работ лаборатории.

Для внесения объективного признака в определение результатов реакции крестами и однообразной оценки её в различных лабораториях, рекомендуется производить оценку в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом, жидкость сливают в одну пробирку. Цвет этой жидкости указывает на 100% гемолиза; из неё приготовляют разведения с меньшими процентами гемолиза следующим образом:

Схема учёта степени гемолиза

Процент гемолиза комплемента. .

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

3°/о взвесь эритроцитов. . .

0,25

0,225

0,2

0,175

0,15

0,125

0,1

0,075

0,06

0,025

Гемоли — зирован — ная жид — кость. .

0,125

0,25

0,375

0,5

0,625

0,75

9,875

1,0

1,125

1,25

Физиоло-гический раствор.

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

Общий объём…

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

Оценка в крестах.

++++

+++

++±

++

+

Положительная

Сомнительная

Отрица —

Тельная

Стандартные пробирки приготовляют перед учётом реакции. Учёт производят тогда, когда эритроциты осели на дно пробирки. При оценке сравнивают цвет жидкости в испытуемой пробирке с цветом в стандартной, и проценты переводят в кресты.

Во всех случаях положительных и сомнительных результатов сыворотки на следующий день повторно исследуют в разведениях: 1 :10—1 :5 с двумя заведомо активными и проверенными перипневмонийными антигенами.

У животных, сыворотка которых дала сомнительную реакцию, через неделю берут кровь повторно для исследования по РСК.

Метки: