Методи зберігання сперми

Короткочасне зберігання сперми при температурі танучого льоду (+2 +4 °С). Для зберігання сперми при вказаній температурі використовують

синтетичні середовища, рецепти яких подано в таблиці.

Таблиця 5.4.1 – Середовища для короткотривалого зберігання сперми

Компоненти середовища Сперма
Бугая Барана Жеребця Кнура
Скорочена назва синтетичного середовища

Вода дистильована, мл

 

ГЦЖ

100

 

ГЦЖ

100

 

ГФЖ

100

 

ЛХЦЖ

100

 

ГХЦ

1000

 

ГХЦС

1000

 

Продовження табл. 5.4.1

Глюкоза, г

Лактоза, г

Цитрат натрію, г

Гідрокарбонат натрію, г

Натрій фосфатнокислий:

12-водний, г

Безводний, г

Калій фосфатнокислий однозаміщений безводний, г

Сульфат амонію, г

Трилон Б, г

Жовток курячого яйця, мл

Спермосан 3, тис. О. Д.

Температура зберігання розбавленої сперми, °С

Максимальний термін зберігання, год

3

 

1,4

 

 

 

 

 

 

 

 

20

75–90

 

2–4

 

72

0,8

 

2,8

 

 

2,08

0,82

 

 

 

 

15–20

25

 

2–4

 

24

3,2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

15–20

25

 

2–4

 

24

11

0,089

0,008

 

 

 

 

 

 

0,1

1,6

25–30

 

2–4

 

48

60

 

3,56

1,2

 

 

 

 

 

 

3,7

 

250–300

 

16–20

 

72

40

 

3,8

0,5

 

 

 

 

 

1,8

2,6

 

250–300

 

16–20

 

72

 

Свіжоотриману сперму бугая або барана розріджують глюкозо-цитратно-жовтковим або молочно-жовтковим (молоко – 100 мл, жовток курячих яєць – 20 мл) середовищем, перевіряють на рухливість і фасують в одноразові стерильні поліетиленові ампули, поліетиленові пробірки об’ємом 1 мл або у флакони з-під антибіотиків. Флакони заповнюють повністю для попередження збовтування сперми при транспортуванні. Поліетиленові ампули запаюють, а пробірки і флакони закривають стерильними нетоксичними пробками і закріплюють їх гумовими кільцями. На кожній ампулі попередньо пишуть номер плідника і дату одержання сперми. Для попередження температурного шоку та загибелі сперміїв охолодження сперми проводять поступово. Для цього заповнені флакони та ампули залишають при кімнатній температурі (18–20 °С) на 20–30 хвилин, після чого їх обгортають шаром вати товщиною 1–2 см і вкладають у поліетиленові мішечки, які поміщають у термос із танучим льодом або в холодильну камеру для поступового охолодження до температури +2 +4 °С.

Для перевезення сперми використовують харчові або спеціальні термоси з льодом. При цьому необхідно попереджати різні струси термосів та слідкувати, щоб мішечки зі спермою були розміщені між шматочками льоду. У зимовий період при низькій температурі навколишнього середовища термоси поміщають у ватні або тканинні чохли для попередження переохолодження сперми.

Зберігання сперми при температурі +5 +20 °С. Для зберігання сперми при такій температурі в синтетичне середовище, з метою гальмування обмінних процесів у статевих клітинах, додають компоненти, які зумовлюють їх анабіоз. Найбільш ефективним для зберігання сперми бугая, є використання двоокису вуглецю (СО2), яке запропонували Н. Ван-Демарк та У. Шарм. При цьому використовують спеціальний розріджувач: води дистильованої – 1000 мл; натрію двовуглекислого – 21 г; натрію цитрату – 23,6 г; калію хлористого – 0,4 г; глюкози – 3,0 г; стрептоциду білого – 3,0 г.

Посудину із вказаним середовищем підігрівають до 96 °С в гарячій воді до розчинення стрептоциду, потім охолоджують до 20–22 °С і насичують двооксидом вуглецю доти, поки рН розріджувача досягне рівня 6,35. Для насичення використовують балонний СО2 або використовують газ, який виділяється в результаті добавки до мармуру 20 %-ного розчину соляної кислоти. Для очищення вугільної кислоти від токсичних домішок її пропускають крізь 15 %-ний розчин двовуглекислої соди і 3 %-ний розчин перманганату калію. Очищеним таким чином двоокисом вуглецю протягом 10 хвилин насичують середовище для розбавлення сперми. Після цього в розріджувач добавляють жовток курячого яйця – 11 мл, 1 млн О. Д. пеніциліну і 1 млн О. Д. стрептоміцину. Підігрівають розріджувач у теплій воді до температури 30–35 °С і розріджують сперму бугая у співвідношенні 1:10–1:40 залежно від її концентрації.

Розріджену сперму зразу ж розфасовують у скляні ампули і запаюють їх, потім поміщають у термос і зберігають при температурі +18 +20 °С.

Для розрідження і зберігання сперми кнура при температурі 16–20 °С протягом 3-х діб використовують синтетичні середовища ГХЦС та ГХЦ (табл. 5.4.1).

Розріджену сперму розфасовують у скляні колби або поліетиленові флакони і зберігають у стерильному боксі-термостаті або в спеціальних термосах для зберігання і транспортування. Колби закривають не герметично (пергаментним папером), без закріплення їх гумовими кільцями. При цьому сперму потрібно обережно двічі на добу перемішувати. Транспортують сперму в спеціальних термосах, побутових сумках-холодильниках, термосах-ящиках, у яких для теплоізоляції використовують паралон. Сперму можна транспортувати лише через 30 хвилин після розрідження. Допускається короткочасне (1–3 год) поступове зниження температури до 14–15 °С або підвищення до 24 °С.

Для розрідження і короткочасного (протягом 48 год) зберігання сперми жеребця при температурі +2 +5 °С використовують середовище ЛХЦЖ. При цьому сперму розбавляють у співвідношенні 1:3 при температурі 25–30 °С. Охолоджують розбавлений еякулят поступово.

Довготривале зберігання сперми в глибокозамороженому стані (кріоконсервація). Довготривале зберігання статевих клітин можливе лише за умови повного їх анабіозу.

Перші досліди з кріоконсервації сперми при температурі –15 °С були проведені І. І.Івановим (1907). Але після розморожування спермії втрачали здатність до прямолінійно-поступального руху, спостерігався лише їх коливний рух.

У 1948 році І. В.Смирнов уперше у світі здійснив заморожування сперми жеребців, бугаїв та баранів у пакетах з алюмінієвої фольги на поверхні твердого двооксиду вуглецю (–79 °С) у парах рідкого азоту. Теоретичною основою цього методу зберігання була гіпотеза про можливість вітрифікації, тобто заморожування біологічних об’єктів без утворення кристалів.

Основною причиною загибелі клітин є утворення кристалів води в плазмі сперми, що призводить до підвищення концентрації в останній солей та цукрів і зумовлює загибель клітин. У подальшому при заморожуванні кристали води утворюються також у цитоплазмі сперміїв, які пошкоджують їхню структурну цілісність.

Щоб уникнути згаданих процесів, застосовують спеціальні способи охолодження сперми та синтетичні середовища, рецепти деяких подано в таблиці 5.4.2.

Таблиця 5.4.2 – Середовища для заморожування і зберігання сперми при

Температурі –196 °С

Компоненти

Середовища

Бугая Жереб-ця Барана
ЛЖГ ЛЖГ1 ЛЖГ2 ЛФРМГЖ ЛХЦЖ ВІКА ГЖЦК ЛЖГТЦГ
Вода дистильована, мл

Лактоза, г

11%-ний розчин лактози або сахарози, мл

Сахароза, г

Фруктоза, г

Рафіноза п’ятиводнева, г

Натрій-кальцієва сіль

ЕДТА, г

Трилон Б, г

Трис-(оксиметил)-аміно-метан, г

Натрій лимоннокислий, г

Магній сірчанокислий, г

Гідрокарбонат натрію, г

Лимонна кислота, г

Гуміарабін, г

Ксиліт, г

Декстрин, г

Токоферол (25–30%-ний масляний розчин), мл

Жовток курячого яйця, мл

Гліцерин, мл

Спермосан-3, тис. О.Д.

Метод розфасування сперми

100

11,5

20,0

5,0

50,0

Грану — ли

63

30,0

7,0

Облиц. грану — ли

100

6,0

1,4

5,0

Облиц. грану — ли

1000

80,5

12,0

19,5

0,1

0,1

200,0

50,0

500–700

Соломин — ки

100

11,0

0,089

0,008

1,6

3,5

25–30

Гранули, пакети

До 100

9,84

0,84

2,0

10,0

5,0

25

Грану — ли

100

8,4

0,135

0,105

0,26

5,0

20,0

6,0

25

Грану-ли

100

14,5

0,6

0,27

6,0

20,0

17,0

25

Гранули

Кріоконсервацію сперми бугаїв Проводять у формі гранул, облицьованих гранул та пайєт (соломинок).

Для розрідження і заморожування сперми бугая у формі Гранул застосовують лактозо-жовткове середовище з гліцерином (табл. 5.4.2). Розріджують сперму після її оцінки так, щоб в одній гранулі (0,2 мл) після відтанення містилось не менше 15 млн рухливих сперміїв. Розріджену сперму (температура 31±1 °С) охолоджують поступово до кімнатної температури (+18 +20), потім до +2 +4 °С протягом 4–7 годин для адаптації, стабілізації і еквілібрації (врівноваження осмотично активних речовин і гліцерину між сперміями і розріджувачем). Заморожування сперми проводять на охолодженій у парах рідкого азоту (температура до –160 –170 °С) фторопластовій пластині з лунками. Фасують за допомогою шприца, піпетки або спеціальної розливочної машини. Після витримування пластини з розфасованою спермою в парах азоту протягом 1–2 хвилин її занурюють у рідкий азот на 2 хвилини, а потім піднімають до верхнього рівня посудини й охолодженою лопаткою збирають гранули в пластмасові охолоджені стаканчики (контейнери), які у свою чергу поміщають у марлеві торбинки, фіксують і занурюють у рідкий азот для тривалого зберігання. До вільного зовнішнього кінця нитки прикріплюють етикетку з даними про бугая-плідника (кличка, інвентарний номер, порода), дату одержання еякуляту та кількість доз.

Для розбавлення і заморожування сперми в Облицьованих гранулах використовують лактозо-жовтково-цитратно-гліцеринове середовище, яке складається з двох частин (№ 1, № 2, табл. 5.4.2). Розведення проводять у спермоприймачі або спеціальному пакеті. Кожну частину середовища заливають в окремі пристрої з поліетиленової плівки, які сполучені між собою еластичними трубками з патрубками циліндра-дозатора. Пристрій із середовищем № 1 поміщають у термостат при температурі 35 °С, другий пристрій із середовищем № 2 – при 18–22 °С. Свіжоотриману сперму розбавляють фракцією № 1 у співвідношенні 1:1 і витримують при кімнатній температурі протягом 5–10 хвилин. Потім розбавляють її середовищем № 2 до потрібної кількості сперміїв у дозі. Сперму розфасовують у полімерну трубку діаметром 3,8–4 мм з товщиною стінок 120 мкм, вкладають її в автомат ПРЖ і сполучають із муфтою спермоприймача. Весь розбавлений еякулят вдавлюється в трубку, після чого її підводять до зварювального вузла автомата, який розділяє трубку на частини із спермодозами об’ємом 0,25–0,33 мл з одночасною герметизацією їх країв і маркіровкою доз. Спермодози з бункера автомата переносять в алюмінієві туби діаметром 40 мм, закривають паралоновими пробками і загвинчують в обойму пристрою для еквілібрації і заморожування сперми. Цей пристрій поміщають у холодильник і витримують при температурі +2 +4 °С протягом 4–6 год при постійному обертанні обойми. Охолоджені туби знімають з апарата, кріплять до них стержні-тримачі і переносять у широкогорлу посудину (“Харків-3”), заповнену рідким азотом.

Для заморожування сперми в соломинках за французькою технологією (касу) використовують середовище “Лецифос” (477 і 488) та “Кріоцифос” (479 і 480).

Сухі заготовки середовища “Лецифос” розчиняють у бідистильованій воді, добавляють жовток, після чого розділяють на дві частини, у кожну з яких (№ 1 і № 2) добавляють гліцерин – відповідно 3 % і 11 %. Спочатку сперму розбавляють середовищем № 1 при температурі 32 °С й охолоджують протягом 45–50 хв до 4 °С у холодильнику або за допомогою танучого льоду. Охолоджену сперму розбавляють середовищем № 2 при температурі 4 °С у співвідношенні 1:1. При цьому середовище додають двома рівними порціями з інтервалом 15 хв, після чого охолодження проводять ще протягом 3–3,5 години.

Розфасовують сперму в попередньо стерилізовані і маркіровані соломинки об’ємом 0,5 або 0,25 мл. Після їх заповнення спермою вільний кінець запаюють ультразвуком і розміщують горизонтально на спеціальну охолоджену підставку, яку переносять у посудину Дюара на металеву сітку. Температуру встановлюють залежно від об’єму соломинок –120 °С або –140 °С, відповідно для пайєт 0,25 і 0,5 мл; витримують їх протягом 10–12 хвилин, а потім переносять у рідкий азот для зберігання.

Середовище “Кріоцифос” більш просте за складом, аніж “Лецифос”, не містить молока, що істотно полегшує проведення оцінки сперми. У її варіант-479 додають антибактеріальні препарати: пеніциллін, стрептоміцин, лінкоміцин і спектиноміцин, а у варіант-480 – тилозин, гентаміцин, лінкоміцин, спектиноміцин.

Для розбавлення і заморожування сперми за байсогальською технологією використовують середовища ЛЦГЖС або ЛФРМГЖ (табл. 5.4.2). Свіжоотриману сперму розбавляють у співвідношенні 1:1 при температурі 27±1 °С і залишають при температурі 18–20 °С на 15 хвилин. При цьому, як правило, використовують 20 % розрахованого об’єму середовища, а залишки додають після температурної витримки. Розбавлену сперму розфасовують у промаркіровані на машині М6-МНС і простерилізовані соломинки, які закупорюють з обох боків скляними кульками за допомогою автоматичного пристрою М6-МУ2-С й охолоджують протягом 3–4 год при +4 +5 °С. Заморожування проводять у два етапи: витримуванням при температурі –150 –180 °С протягом 7 хвилин та наступним зануренням у рідкий азот. Зберігають пайєти у спеціальних стаканах.

Для заморожування і зберігання Сперму жеребця Розбавляють середовищем ЛХЦЖ із додаванням гліцерину. Розріджують одномоментно у співвідношенні 1:3, після чого її витримують протягом 2 годин у холодильнику на поверхні сухого льоду. Заморожують сперму жеребця в алюмінієвих пакетах об’ємом 13 і 25 мл або у формі відкритих гранул. Перед використанням пакети охолоджують, а після їх заповнення обережно витісняють повітря з них і двічі закочують кінці. Пакети зі спермою поміщають у спеціальні тримачі з пінопластовими поплавцями і переносять у широкогорлу посудину Дюара, де пакети витримують протягом 5–7 хвилин у парах рідкого азоту, а потім – безпосередньо в рідині. В одній спермодозі після відтанення повинно міститися 300–400 мл рухливих сперміїв.

Заморожування Сперми барана Практикують рідше, аніж бугая. Це пов’язано з низькою заплідненістю маток внаслідок осіменіння кріоконсервованою спермою та особливостями технології осіменіння у вівчарстві і строками її застосування.

Для розрідження і заморожування доцільно використовувати синтетичні середовища ВІКА (з антиоксидантом), ГЖЦК-трисбуферну (з полісахаридом декстрином) та ЛЖГТЦГ (з полісахаридом гуміарабіком).

Розріджену сперму охолоджують упродовж 2–3 годин до температури +2 +4 °С у флаконах. Для цього їх занурюють у кювету з теплою (20–25 °С) водою і поміщають у холодильник, після чого кювету занурюють у танучий лід до початку заморожування сперми.

Сперму заморожують на поверхні сухого льоду або на поверхні охолодженої до –80 °С фторопластової пластини. Для забезпечення вказаної температури пластину піднімають за допомогою штатива на рівень верхнього краю широкогорлої посудини з рідким азотом і витримують 4–6 хвилин. Потім у лунки пластини розфасовують по 0,2 мл сперми. Як тільки сперма затвердіє, пластину опускають нижче і витримують над поверхнею рідкого азоту на відстані 3–5 см протягом 1,5–2 хвилин, потім занурюють на 1 хв в рідину. Після закінчення заморожування пластину витягують з азоту і збирають гранули в алюмінієві туби або мішечки з тонкої алюмінієвої фольги.

Методи заморожування сперми кнурів і тривалого зберігання її розроблені, але практичного застосування в країнах СНД не мають.

На пунктах штучного осіменіння сперму плідників зберігають у посудинах Дьюара СДС-50, СДС-20, “Харків-34 А” та ін. У них же і транспортують сперму. Ці посудини являють собою сталеві або алюмінієві двостінні ємкості з вакуумно-порошковою або багатошарово-вакуумною ізоляцією. Вмістимість їх становить від 4 до 50 л, добова витрата азоту – 1–3 %, залежно від розмірів посудини і якості ізоляції. Періодично посудини поповнюють рідким азотом, який доставляють на пункти штучного осіменіння в транспортних резервуарах на автомобілях-азотовозах.

ЛІТЕРАТУРА

1. Ветеринарное акушерство и гинекология / А. П.Студенцов, В. С.Шипилов, Л. Г.Субботина, О. Н.Преображенский; Под ред. В. С.Шипилова.– 6-е изд., испр. и доп.– М.: Агропромиздат, 1986.– 480 с.

2. Методические указания к лабораторно-практическим занятиям по курсу “Искусственное осеменение с.-х. животных” / Белоцерковский с.-х. ин-т; Сост. Г. Г.Харута, И. И.Бабак, Ю. Ф.Задвирный и др.– Белая Церковь, 1991.– 56 с.

3. Штучне осіменіння корів і телиць / Г. Г.Харута, С. С.Волков, А. Й.Краєвський та ін.– Метод. рекомендації – Біла Церква, 1999.– 46 с.

Метки: ,