Методи зберігання сперми

Короткочасне зберігання сперми при температурі танучого льоду (+2 +4 °С). Для зберігання сперми при вказаній температурі використовують

синтетичні середовища, рецепти яких подано в таблиці.

Таблиця 5.4.1 – Середовища для короткотривалого зберігання сперми

Продовження табл. 5.4.1

Свіжоотриману сперму бугая або барана розріджують глюкозо-цитратно-жовтковим або молочно-жовтковим (молоко – 100 мл, жовток курячих яєць – 20 мл) середовищем, перевіряють на рухливість і фасують в одноразові стерильні поліетиленові ампули, поліетиленові пробірки об’ємом 1 мл або у флакони з-під антибіотиків. Флакони заповнюють повністю для попередження збовтування сперми при транспортуванні. Поліетиленові ампули запаюють, а пробірки і флакони закривають стерильними нетоксичними пробками і закріплюють їх гумовими кільцями. На кожній ампулі попередньо пишуть номер плідника і дату одержання сперми. Для попередження температурного шоку та загибелі сперміїв охолодження сперми проводять поступово. Для цього заповнені флакони та ампули залишають при кімнатній температурі (18–20 °С) на 20–30 хвилин, після чого їх обгортають шаром вати товщиною 1–2 см і вкладають у поліетиленові мішечки, які поміщають у термос із танучим льодом або в холодильну камеру для поступового охолодження до температури +2 +4 °С.

Для перевезення сперми використовують харчові або спеціальні термоси з льодом. При цьому необхідно попереджати різні струси термосів та слідкувати, щоб мішечки зі спермою були розміщені між шматочками льоду. У зимовий період при низькій температурі навколишнього середовища термоси поміщають у ватні або тканинні чохли для попередження переохолодження сперми.

Зберігання сперми при температурі +5 +20 °С. Для зберігання сперми при такій температурі в синтетичне середовище, з метою гальмування обмінних процесів у статевих клітинах, додають компоненти, які зумовлюють їх анабіоз. Найбільш ефективним для зберігання сперми бугая, є використання двоокису вуглецю (СО2), яке запропонували Н. Ван-Демарк та У. Шарм. При цьому використовують спеціальний розріджувач: води дистильованої – 1000 мл; натрію двовуглекислого – 21 г; натрію цитрату – 23,6 г; калію хлористого – 0,4 г; глюкози – 3,0 г; стрептоциду білого – 3,0 г.

Посудину із вказаним середовищем підігрівають до 96 °С в гарячій воді до розчинення стрептоциду, потім охолоджують до 20–22 °С і насичують двооксидом вуглецю доти, поки рН розріджувача досягне рівня 6,35. Для насичення використовують балонний СО2 або використовують газ, який виділяється в результаті добавки до мармуру 20 %-ного розчину соляної кислоти. Для очищення вугільної кислоти від токсичних домішок її пропускають крізь 15 %-ний розчин двовуглекислої соди і 3 %-ний розчин перманганату калію. Очищеним таким чином двоокисом вуглецю протягом 10 хвилин насичують середовище для розбавлення сперми. Після цього в розріджувач добавляють жовток курячого яйця – 11 мл, 1 млн О. Д. пеніциліну і 1 млн О. Д. стрептоміцину. Підігрівають розріджувач у теплій воді до температури 30–35 °С і розріджують сперму бугая у співвідношенні 1:10–1:40 залежно від її концентрації.

Розріджену сперму зразу ж розфасовують у скляні ампули і запаюють їх, потім поміщають у термос і зберігають при температурі +18 +20 °С.

Для розрідження і зберігання сперми кнура при температурі 16–20 °С протягом 3-х діб використовують синтетичні середовища ГХЦС та ГХЦ (табл. 5.4.1).

Розріджену сперму розфасовують у скляні колби або поліетиленові флакони і зберігають у стерильному боксі-термостаті або в спеціальних термосах для зберігання і транспортування. Колби закривають не герметично (пергаментним папером), без закріплення їх гумовими кільцями. При цьому сперму потрібно обережно двічі на добу перемішувати. Транспортують сперму в спеціальних термосах, побутових сумках-холодильниках, термосах-ящиках, у яких для теплоізоляції використовують паралон. Сперму можна транспортувати лише через 30 хвилин після розрідження. Допускається короткочасне (1–3 год) поступове зниження температури до 14–15 °С або підвищення до 24 °С.

Для розрідження і короткочасного (протягом 48 год) зберігання сперми жеребця при температурі +2 +5 °С використовують середовище ЛХЦЖ. При цьому сперму розбавляють у співвідношенні 1:3 при температурі 25–30 °С. Охолоджують розбавлений еякулят поступово.

Довготривале зберігання сперми в глибокозамороженому стані (кріоконсервація). Довготривале зберігання статевих клітин можливе лише за умови повного їх анабіозу.

Перші досліди з кріоконсервації сперми при температурі –15 °С були проведені І. І.Івановим (1907). Але після розморожування спермії втрачали здатність до прямолінійно-поступального руху, спостерігався лише їх коливний рух.

У 1948 році І. В.Смирнов уперше у світі здійснив заморожування сперми жеребців, бугаїв та баранів у пакетах з алюмінієвої фольги на поверхні твердого двооксиду вуглецю (–79 °С) у парах рідкого азоту. Теоретичною основою цього методу зберігання була гіпотеза про можливість вітрифікації, тобто заморожування біологічних об’єктів без утворення кристалів.

Основною причиною загибелі клітин є утворення кристалів води в плазмі сперми, що призводить до підвищення концентрації в останній солей та цукрів і зумовлює загибель клітин. У подальшому при заморожуванні кристали води утворюються також у цитоплазмі сперміїв, які пошкоджують їхню структурну цілісність.

Щоб уникнути згаданих процесів, застосовують спеціальні способи охолодження сперми та синтетичні середовища, рецепти деяких подано в таблиці 5.4.2.

Таблиця 5.4.2 – Середовища для заморожування і зберігання сперми при

Температурі –196 °С

Кріоконсервацію сперми бугаїв Проводять у формі гранул, облицьованих гранул та пайєт (соломинок).

Для розрідження і заморожування сперми бугая у формі Гранул застосовують лактозо-жовткове середовище з гліцерином (табл. 5.4.2). Розріджують сперму після її оцінки так, щоб в одній гранулі (0,2 мл) після відтанення містилось не менше 15 млн рухливих сперміїв. Розріджену сперму (температура 31±1 °С) охолоджують поступово до кімнатної температури (+18 +20), потім до +2 +4 °С протягом 4–7 годин для адаптації, стабілізації і еквілібрації (врівноваження осмотично активних речовин і гліцерину між сперміями і розріджувачем). Заморожування сперми проводять на охолодженій у парах рідкого азоту (температура до –160 –170 °С) фторопластовій пластині з лунками. Фасують за допомогою шприца, піпетки або спеціальної розливочної машини. Після витримування пластини з розфасованою спермою в парах азоту протягом 1–2 хвилин її занурюють у рідкий азот на 2 хвилини, а потім піднімають до верхнього рівня посудини й охолодженою лопаткою збирають гранули в пластмасові охолоджені стаканчики (контейнери), які у свою чергу поміщають у марлеві торбинки, фіксують і занурюють у рідкий азот для тривалого зберігання. До вільного зовнішнього кінця нитки прикріплюють етикетку з даними про бугая-плідника (кличка, інвентарний номер, порода), дату одержання еякуляту та кількість доз.

Для розбавлення і заморожування сперми в Облицьованих гранулах використовують лактозо-жовтково-цитратно-гліцеринове середовище, яке складається з двох частин (№ 1, № 2, табл. 5.4.2). Розведення проводять у спермоприймачі або спеціальному пакеті. Кожну частину середовища заливають в окремі пристрої з поліетиленової плівки, які сполучені між собою еластичними трубками з патрубками циліндра-дозатора. Пристрій із середовищем № 1 поміщають у термостат при температурі 35 °С, другий пристрій із середовищем № 2 – при 18–22 °С. Свіжоотриману сперму розбавляють фракцією № 1 у співвідношенні 1:1 і витримують при кімнатній температурі протягом 5–10 хвилин. Потім розбавляють її середовищем № 2 до потрібної кількості сперміїв у дозі. Сперму розфасовують у полімерну трубку діаметром 3,8–4 мм з товщиною стінок 120 мкм, вкладають її в автомат ПРЖ і сполучають із муфтою спермоприймача. Весь розбавлений еякулят вдавлюється в трубку, після чого її підводять до зварювального вузла автомата, який розділяє трубку на частини із спермодозами об’ємом 0,25–0,33 мл з одночасною герметизацією їх країв і маркіровкою доз. Спермодози з бункера автомата переносять в алюмінієві туби діаметром 40 мм, закривають паралоновими пробками і загвинчують в обойму пристрою для еквілібрації і заморожування сперми. Цей пристрій поміщають у холодильник і витримують при температурі +2 +4 °С протягом 4–6 год при постійному обертанні обойми. Охолоджені туби знімають з апарата, кріплять до них стержні-тримачі і переносять у широкогорлу посудину (“Харків-3”), заповнену рідким азотом.

Для заморожування сперми в соломинках за французькою технологією (касу) використовують середовище “Лецифос” (477 і 488) та “Кріоцифос” (479 і 480).

Сухі заготовки середовища “Лецифос” розчиняють у бідистильованій воді, добавляють жовток, після чого розділяють на дві частини, у кожну з яких (№ 1 і № 2) добавляють гліцерин – відповідно 3 % і 11 %. Спочатку сперму розбавляють середовищем № 1 при температурі 32 °С й охолоджують протягом 45–50 хв до 4 °С у холодильнику або за допомогою танучого льоду. Охолоджену сперму розбавляють середовищем № 2 при температурі 4 °С у співвідношенні 1:1. При цьому середовище додають двома рівними порціями з інтервалом 15 хв, після чого охолодження проводять ще протягом 3–3,5 години.

Розфасовують сперму в попередньо стерилізовані і маркіровані соломинки об’ємом 0,5 або 0,25 мл. Після їх заповнення спермою вільний кінець запаюють ультразвуком і розміщують горизонтально на спеціальну охолоджену підставку, яку переносять у посудину Дюара на металеву сітку. Температуру встановлюють залежно від об’єму соломинок –120 °С або –140 °С, відповідно для пайєт 0,25 і 0,5 мл; витримують їх протягом 10–12 хвилин, а потім переносять у рідкий азот для зберігання.

Середовище “Кріоцифос” більш просте за складом, аніж “Лецифос”, не містить молока, що істотно полегшує проведення оцінки сперми. У її варіант-479 додають антибактеріальні препарати: пеніциллін, стрептоміцин, лінкоміцин і спектиноміцин, а у варіант-480 – тилозин, гентаміцин, лінкоміцин, спектиноміцин.

Для розбавлення і заморожування сперми за байсогальською технологією використовують середовища ЛЦГЖС або ЛФРМГЖ (табл. 5.4.2). Свіжоотриману сперму розбавляють у співвідношенні 1:1 при температурі 27±1 °С і залишають при температурі 18–20 °С на 15 хвилин. При цьому, як правило, використовують 20 % розрахованого об’єму середовища, а залишки додають після температурної витримки. Розбавлену сперму розфасовують у промаркіровані на машині М6-МНС і простерилізовані соломинки, які закупорюють з обох боків скляними кульками за допомогою автоматичного пристрою М6-МУ2-С й охолоджують протягом 3–4 год при +4 +5 °С. Заморожування проводять у два етапи: витримуванням при температурі –150 –180 °С протягом 7 хвилин та наступним зануренням у рідкий азот. Зберігають пайєти у спеціальних стаканах.

Для заморожування і зберігання Сперму жеребця Розбавляють середовищем ЛХЦЖ із додаванням гліцерину. Розріджують одномоментно у співвідношенні 1:3, після чого її витримують протягом 2 годин у холодильнику на поверхні сухого льоду. Заморожують сперму жеребця в алюмінієвих пакетах об’ємом 13 і 25 мл або у формі відкритих гранул. Перед використанням пакети охолоджують, а після їх заповнення обережно витісняють повітря з них і двічі закочують кінці. Пакети зі спермою поміщають у спеціальні тримачі з пінопластовими поплавцями і переносять у широкогорлу посудину Дюара, де пакети витримують протягом 5–7 хвилин у парах рідкого азоту, а потім – безпосередньо в рідині. В одній спермодозі після відтанення повинно міститися 300–400 мл рухливих сперміїв.

Заморожування Сперми барана Практикують рідше, аніж бугая. Це пов’язано з низькою заплідненістю маток внаслідок осіменіння кріоконсервованою спермою та особливостями технології осіменіння у вівчарстві і строками її застосування.

Для розрідження і заморожування доцільно використовувати синтетичні середовища ВІКА (з антиоксидантом), ГЖЦК-трисбуферну (з полісахаридом декстрином) та ЛЖГТЦГ (з полісахаридом гуміарабіком).

Розріджену сперму охолоджують упродовж 2–3 годин до температури +2 +4 °С у флаконах. Для цього їх занурюють у кювету з теплою (20–25 °С) водою і поміщають у холодильник, після чого кювету занурюють у танучий лід до початку заморожування сперми.

Сперму заморожують на поверхні сухого льоду або на поверхні охолодженої до –80 °С фторопластової пластини. Для забезпечення вказаної температури пластину піднімають за допомогою штатива на рівень верхнього краю широкогорлої посудини з рідким азотом і витримують 4–6 хвилин. Потім у лунки пластини розфасовують по 0,2 мл сперми. Як тільки сперма затвердіє, пластину опускають нижче і витримують над поверхнею рідкого азоту на відстані 3–5 см протягом 1,5–2 хвилин, потім занурюють на 1 хв в рідину. Після закінчення заморожування пластину витягують з азоту і збирають гранули в алюмінієві туби або мішечки з тонкої алюмінієвої фольги.

Методи заморожування сперми кнурів і тривалого зберігання її розроблені, але практичного застосування в країнах СНД не мають.

На пунктах штучного осіменіння сперму плідників зберігають у посудинах Дьюара СДС-50, СДС-20, “Харків-34 А” та ін. У них же і транспортують сперму. Ці посудини являють собою сталеві або алюмінієві двостінні ємкості з вакуумно-порошковою або багатошарово-вакуумною ізоляцією. Вмістимість їх становить від 4 до 50 л, добова витрата азоту – 1–3 %, залежно від розмірів посудини і якості ізоляції. Періодично посудини поповнюють рідким азотом, який доставляють на пункти штучного осіменіння в транспортних резервуарах на автомобілях-азотовозах.

ЛІТЕРАТУРА

1. Ветеринарное акушерство и гинекология / А. П.Студенцов, В. С.Шипилов, Л. Г.Субботина, О. Н.Преображенский; Под ред. В. С.Шипилова.– 6-е изд., испр. и доп.– М.: Агропромиздат, 1986.– 480 с.

2. Методические указания к лабораторно-практическим занятиям по курсу “Искусственное осеменение с.-х. животных” / Белоцерковский с.-х. ин-т; Сост. Г. Г.Харута, И. И.Бабак, Ю. Ф.Задвирный и др.– Белая Церковь, 1991.– 56 с.

3. Штучне осіменіння корів і телиць / Г. Г.Харута, С. С.Волков, А. Й.Краєвський та ін.– Метод. рекомендації – Біла Церква, 1999.– 46 с.