Методика постановки реакции связывания комплемента при случной

Реакция ставится в водяной бане в общем объёме 2,5 см3 всех компонентов при 37—38° С.

Компоненты реакции:

А) гемолизин— рабочий титр не менее 1 :1 000,

Б) трипанозомный антиген,

В) комплемент—свежая сыворотка морской свинки,

г) испытуемые сыворотки и сыворотки нормальная и позитивная, инактивированные в день постановки реакции при 56-58 ºС в течение 30 минут.

д) 2,5о/о взвесь эритроцитов от осадка в физиологическом растворе (1 :40),

е) физиологический раствор (0,85%) химически чистой поваренной соли на дистиллированной воде.

Титрация компонентов реакции

Перед реакцией производят титрацию гемолизина, комплемента в гемолитической системе и комплемента на сыворотках.

Титрация гемолизина

При титрации гемолизина делают следующие разведения (1:100-основное разведение): 1 :500; 1 :1 000; 1 :1 500; 1 :2 000; 1 :2 500; 1 :3000. Каждое разведение испытывается в дозе 0,5.

Если гемолизин консервирован карболовой кислотой, то берут 0,1 см3 гемолизина на 9,9 см3 физиологического раствора (1:100); если же он консервирован глицерином, то следует брать 0,2 см3 гемолизина на 9,8 см3 физиологического раствора (обычно на фабрике

Принято консервировать гемолизин глицерином).

Комплемент берут по 0,5 см3 из разведения 1 : 20 и эритроциты по 0,5 см3 на 2,5 о/о взвеси из осадка. Взамен трипанозомного антигена и сыворотки лошади в пробирки прибавляют 1,0 см3 физиологического раствора. Время течения реакции 10 минут в водяной бане при 37-38° С.

При титрации гемолизина ставят следующие контроли: 1) контроль гемолизина (т. е. гемолизин + эритроциты -|- физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии комплемента), 2) комплемента (т. е. комплемент + эритроциты + физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии гемолизина) и 3) физиологического раствора (т. е. эритроциты + физиологический раствор до объёма 2,5 см3 при отсутствии гемолизина и комплемента). Во всех контрольных пробирках гемолиз эритроцитов отсутствует. Титр гемо-

Лизина—наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,5 см3 взвеси эритроцитов при комплементе 0,5 см3 разведения 1 :20 при 37—38° С в течение 10 минут.

Для рабочего титра гемолизина при дальнейшей титрации комплемента, а также для реакции при испытании сывороток (главного опыта) берут удвоенный титр гемолизина. Для дальнейшей работы допускается смешивание гемолизина и эритроцитов в одинаковых объёмах.

Титрация комплемента в гемолигической системе

Комплемент исследуется с интервалами по 0,03 в следующих дозах: 0,1; 0.13; 0.16; 0,19; 0,22 и т. д. до 0,49 комплемента из разведения 1 ;20. В каждую пробирку вместо недостающего количеств до объёма 0,5 см3 доливают физиологический раствор (в первую пробирку 0,4 см3 физиологического раствора, во вторую—0,37 и т. д.).

Схема титрации комплемента в гемолитической системе

Комплемент

1 :20 Недостаю-щее количес — тво физио — логического раствора

0,1

0,4

0,5

0,5

1,0

0,13

0,37

0,5

0,5

1,0

0,16

0,34

0,5

0,5

1,0

0,19

0,31

0,5

0,5

1,0

0,22

0,28

0,5

0,5

1,0

0,25

0,25

0,5

0,5

1,0

0,28

0,22

0,5

0,5

1,0

0,31

0,19

0,5

0,5

1,0

0,34

0,16

0,5

0,5

1,0

0,37

0,13

0,5

0,5

1,0

0,4

0,1

0,5

0,5

1,0

0,43

0,07

0,5

0,5

1,0

0,46

0,04

0,5

0,5

1,0

0,49

0,01

0,5

0,5

1,0

Гемолизин в рабочем титре. . . Эритроциты бара — на 1:40 . . . . Физиологический раствор вместо антигена сыворотки…..

Водяная баня 10 минут при 37—38° С.

Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее количество, потребное для полного гемолиза 0,5 см3 взвеси эритроцитов при рабочем титре гемолизина в течение 10 минут в водяной бане при 37—38° С.

Подтитровка комплемента на сыворотках

Компоненты: трипанозомная позитивная сыворотка ++++ и ++, консервированная 0,5 °/о карболовой кислотой (9,0 см3 сыворотки + 1 см3 5 о/о-раствора карболовой кислоты на физиологическом растворе).

Нормальных сывороток—две. Сыворотки берут той же давности, что и испытуемые. Трипанозомные и нормальные сыворотки наливают в пробирки по 0,1 (т. е. из разведения 1 :5 по 0,5) и комплемент титруется из них с антигеном и без антигена. Дозы комплемента (из основного разведения 1 :20) разливают на 2 интервала ниже против титра его в гемолитической системе: если титр комплемента в гемолитической системе 0,25 о/о, то начинают с 0,19; 0,22; 0,25; 0,28 и т. д. Во все пробирки вместо недостающего до 0,5 см3 количества комплемента добавляют физиологический раствор: в 1-ю пробирку—0,31, во 2-ю—0,28 и т. д. После разливки нормальных и трипанозомных сывороток, трипанозомного антигена и соответствующих доз комплемента пробирки для связывания ставят на 20 минут в водяную баню при 37°С, после чего добавляют по 0,5 гемолизина в рабочем титре и эритроцитов барана (2,5 о/о взвеси). Время реакции в гемолитической системе 15 минут.

Титр комплемента—минимальное количество его, потребное для полного гемолиза взвеси эритроцитов в пробирках с нормальными сыворотками, с антигеном и без антигена, и с трипанозомными без антигена, при соответствующей задержке гемолиза в трипанозомной сстворотке с антигеном, при 37° С в течение 15 минут.,

Разведение комплемента в установленном титре

Пример. Нужно исследовать 100 пробирок. Титр комплемента в бактериологической системе 0,3 в разведении 1 :20, т. е. в каждой пробирке чистого комплемента имеется 0,015 (0,3 :20 ==0,015), следовательно, 0,015Х100 ===115 см3 чистого комплемента и 48,5 см3 физиологического раствора.

Главный опыт

Инактивированные испытуемые сыворотки исследуются в дозе 0,1 и 0,05. Контроля без антигена—только в дозе 0,1. При массовом исследовании допускается постановка реакции в одной пробирке с дозой сыворотки 0,1 с дополнительным исследованием всех сывороток, давших задержку гемолиза в дозах 0,1 и 0,05. Остальные компоненты—в установленных титрах и объёме. Связывание продолжается 20 минут и гемолизирование 15 минут.

Основные контроли главного опыта. 1. Нормальные и позитивный сыворотки с антигеном и без антигена в дозах 0,1.

2. Антиген в рабочей дозе без сыворотки.

3. Контроля гемолитической системы.

Оценка результатов реакции. Официальная диагностическая доза сыворотки, по которой даётся результат (ответ),—0,1. Доза 0,05 является вспомогательно-контрольной, и результаты, полученные с ней, оцениваются вдвойне крестами, например, ++ оценивается за ++++, + за ++ и т. д.

Результат реакции оценивается 2 раза. Первый раз тотчас после водяной бани, второй—через 12 часов стояния проб при комнатной температуре. Оценка даётся по следующей схеме:

а) положительная реакция ………………………….++++, +++, ++

б) сомнительная » ………………………….. + + —

в) отрицательная » …………………………. —

Результат исследования выражается словами: положительная, сомнительная и отрицательная реакции, с указанием количества крестов.

Данные всех опытов титраций и особенности серологических реакций вносятся в дневник серологических работ лаборатории. Для определения результатов реакции в процентах гемолиза изготовляют следующую шкалу.

Из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом эритроцитов и жидкость сливают в 1 пробирку. Эта жидкость по цвету равняется 100 о/о гемолиза. Из неё приготовляют разведения с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:

пробирок

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Гемолизировапная жидкость. Физиологический раствор…. Процент гемолиза…….

0,2 1,8 10

0,4 1,6 20

0,6 1,4 30

0,8 1,2 40

1,0 1,0 50

1,2 0,8 60

1,4 0,6 70

1,6 0,4 80

1,8 0,2

90

Шкалой пользуются тогда, когда эритроциты в пробирках главного опыта осели на дно. Оценку производят путём сравнения процента гемолиза и количества крестов.

Представленные на исследование сыворотки должны быть свежими (не больше 1—2 дней с момента взятия). Сыворотки, загнившие и гемолизированные для исследования непригодны. Сыворотки здоровых ослов при подтитровке комплемента на нормальных лошадиных сыворотках дают неспецифическую задержку.

Титрация трипанозомного антигена

Для титраций берут две позитивные трипанозомные сыворотки

( ++++, ++) и 3-4 нормальные сыворотки. Позитивные сыворотки предварительно разводят следующим образом:

2,0см3 сыворотки +8,0 см3 физиолог, раствора равно разведению 1:5

1,0 » +9 « » » » 1:10

0,5 » +9,5 » » » » 1:20

0,25 » +9,75 » » » » 1:40

Нормальную сыворотку берут в дозе 0,1. Комплемент, гемолизия и эритроциты—в рабочих титрах, температура водяной бани и время—обычные. Схема реакции следующая:

Разведение антигена

1:10

1:20

1:40

1:60

1:80

1:100

1:120

1:140

1:160

1:180

Антиген

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Первое разведе — ние сыворотки.

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Комплемент ;

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0.5

0.5

0,5

0,5

Физиологичес-кий раствор

0,5

20 минут в водяной бане при 37° С.

Гемолизин • Взвесь эритроцитов

0,5 0,5

0,5 0,5

0,5 0,5

0,5 0,5

0,5 0,5

0,5

0,5

0,5 0,5

0,5 0,5

0,5 0,5

0,5

15 минут в водяной бане при 37° С.

При мало активных антигенах титрацию их проводят также в 10 пробирках, но в более частых разведениях.

По этой же схеме ставят и остальные разведения сыворотки. При отсутствии высокоактивных сывороток берут сыворотки, давшие в предыдущих исследованиях с другим антигеном в разведении 1:5 ++++, +++, ++ и +.

Титром антигена считается то разведение, которое даёт те же результаты на указанных сыворотках, которые были получены с прежним антигеном.

В качестве контроля берут антиген во всех разведениях без сыворотки, а также все сыворотки с вытитрованным ранее антигеном и без антигена.

Примерный результат титрации следующий (определение произведено в крестах).

Разведение антигена

1:10

1:20

1:40

1:60

1:80

1:100

1:120

1:140

1:160

1:180

Разведение сыворотки 1:5 . .

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

То же 1:10 …

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

+

То же 1:20 . .

+++

++

+

То же 1:40 …

+

Например, предполагаемый титр антигена 1:140, рабочий титр—1:70.

При встряхивании антиген должен давать незначительное помутнение без грубых неразбивающихся комков и хлопьев.

Срок годности антигена до четырёх месяцев при условии периодической проверки его титра каждые две декады.

Антиген должен сохраняться в тёмном прохладном месте.

Метки: